pág. 5718
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA Y TOXICIDAD DE CINCO
ESPECIES DEL GÉNERO SOBRALIA
(ORCHIDACEAE) DEL ECUADOR
EVALUATION OF THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND
TOXICITY OF FIVE SPECIES OF THE GENUS SOBRALIA
(ORCHIDACEAE) FROM ECUADOR
Ana Lucia Marcillo Chiguano
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
Marco Fernando Cerna Cevallos
Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador
pág. 5719
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v8i2.10983
Evaluación de la Actividad Antibacteriana y Toxicidad de Cinco Especies
del Género Sobralia (Orchidaceae) del Ecuador
Ana Lucia Marcillo Chiguano1
lucy_ana87@hotmail.com
https://orcid.org/0009-0005-8698-1720
Grupo de investigación Nunkui Wakan
Universidad Politécnica Salesiana
Ecuador
Marco Fernando Cerna Cevallos
mcerna@ups.edu.ec
https://orcid.org/0000-0002-0911-9900
Grupo de investigación Nunkui Wakan
Universidad Politécnica Salesiana
Ecuador
RESUMEN
El género Sobralia (Orchidaceae) es una especie vegetal presente en el Ecuador, la misma que carece
de poca investigación sobre su actividad biológica. Por lo que este estudio se planteó con el objetivo
de determinar la actividad antibacteriana y toxicidad de cinco especies de este género. Las siete
muestras vegetales fueron recolectadas en cinco provincias del país, los tejidos vegetales fueron
procesados y se obtuvieron extractos fluidos de las hojas mediante la maceración. Los extractos se
emplearon para determinar la actividad antibacteriana en relación con las bacterias patógenas, tales
como (Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus) mediante
el uso del método de disco placa de Kirby-Bauer. Para la prueba de letalidad de la Artemia Salina se
trabajó con los extractos a diferentes concentraciones 5, 10, 25, 50,100 μg/mL y se estableció la
concentración letal 50. Dentro de los resultados, se constató que el extracto de Sobralia sp inhibió el
crecimiento de Escherichia coli ya que presentó un halo de 15mm. En lo que respecta a la toxicidad,
el extracto de Sobralia pulcherrima es alta con un CL50 de 81,73µg/ml, mientras que Sobralia sp y
Sobralia ecuadorana son moderadas, Sobralia rosea es ligera y Sobralia cf. virginalis es inocua. En
virtud de los resultados expuestos, la especie Sobralia sp presentó actividad antibacteriana y una
toxicidad moderada, por lo que podría ser considerada con fines de investigación farmacéutica. Así
como Sobralia pulcherrima que por su alta toxicidad sugiere tener potencial antitumoral para el
estudio de citotoxicidad en líneas celulares.
Palabras clave: orquídeas, sobralia, extractos, antibacteriana, toxicidad
1
Autor principal.
Correspondencia: lucy_ana87@hotmail.com
pág. 5720
Evaluation of the antibacterial Activity and Toxicity of Five Species of the
Genus Sobralia (Orchidaceae) from Ecuador
ABSTRACT
The genus Sobralia (Orchidaceae) is a plant species present in Ecuador, which lacks little research on
its biological activity. Therefore, this study was proposed with the objective of determining the
antibacterial activity and toxicity of five species of this genus. The seven plant samples were collected
in five provinces of the country, the plant tissues were processed and fluid extracts of the leaves were
obtained through maceration. The extracts were used to determine the antibacterial activity in relation
to pathogenic bacteria, such as (Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Salmonella typhi,
Staphylococcus aureus) by using the Kirby-Bauer disc plate method. For the lethality test of Artemia
Salina, the extracts were worked at different concentrations 5, 10, 25, 50,100 μg/mL and the lethal
concentration 50 was established. Among the results, it was found that the Sobralia sp extract
inhibited the growth of Escherichia coli since it presented a 15mm halo. Regarding toxicity, the
Sobralia pulcherrima extract is high with an LC50 of 81.73µg/ml, while Sobralia sp and Sobralia
ecuadorana are moderate, Sobralia rosea is light and Sobralia cf. virginalis is harmless. Based on the
results presented, the species Sobralia sp presented antibacterial activity and moderate toxicity, so it
could be considered for pharmaceutical research purposes. As well as Sobralia pulcherrima, which
due to its high toxicity suggests having antitumor potential for the study of cytotoxicity in cell lines.
Keywords: orchids, sobralia, extracts, antibacterial, toxicity
Artículo recibido 20 marzo 2024
Aceptado para publicación: 15 abril 2024
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INTRODUCCIÓN
Las orquídeas se destacan por la belleza de sus flores, poseen un alto valor ornamental, cuentan con
una amplia gama de colores, aromas y formas (Chaparro , 2018). Se han descrito alrededor 25.000-
30.000 especies y casi 900 géneros, por lo que es considerada como la más diversa de las plantas
herbáceas (Vázquez, 2023).
El género Sobralia objeto de esta investigación cuenta con alrededor de 200 especies distribuidas
desde el sur de México hasta Brasil y Bolivia (Baranow, 2017). En Ecuador el género Sobralia cuenta
con 39 especies de las cuales 11 son especies endémicas es decir que no se encuentran en ningún otro
lugar del mundo (Dodson, 1999).
Las orquídeas por su característica ornamental tienen importancia comercial y económica, sin
embargo, en China, India, Europa y Centroamérica son usadas como medicina tradicional (Minh,
2016).
(Chen & Chen , 1935) reportan el estudio de la actividad biológica de compuestos aislados de las
orquídeas, quienes estudiaron el alcaloide llamado Dendrobina, el cual está presente en la orquídea
Dendrobium nobile, la misma que se usaba en la medicina china “Chin-Shi-Hu”.
En México Maxillaria glomerata se la usa como medicina tradicional para tratar el dolor de estómago
y otras enfermedades gastrointestinales (Pérez, 2010).
(López, 2016) encontró que los extractos hidroetanólicos de las hojas y pseudobulbos de Laelia
furfurácea tienen actividad antioxidante.
(Richa , 2021) determinó que el extracto etanólico de las hojas de Coelogyne fimbriata, tiene
propiedades antimicrobianas frente a las bacterias Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y Yersinia
enterocolitica.
De acuerdo con los estudios reportados sobre las propiedades de las orquídeas, el género Sobralia
cuenta solo con la descripción botánica, lo que sugiere la necesidad de realizar investigaciones
científicas, de esta especie que se encuentra en el país para determinar si la misma posee compuestos
activos, útiles para el campo cosmético o farmacéutico.
La presente investigación se planteó como objetivo, determinar la actividad antibacteriana mediante
antibiograma, con la prueba de disco-placa Kirby-Bauer frente a cepas bacterianas E. coli, S. aureus,
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P. aeruginosa y Salmonella typhi, además se determinó el nivel de toxicidad de los extractos frente a
nauplios de Artemia Salina, para establecer la concentración letal media (CL50) de siete muestras de
individuos del género Sobralia (Orchidaceae) del Ecuador.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Las muestras vegetales de Sobralia fueron recolectadas en los meses de mayo, julio, agosto del año
2023, en las provincias de Cotopaxi, Napo, Pastaza y Santo Domingo de los Tsáchilas, ver tabla 1.
Tabla 1. Cronograma de especies recolectadas. - Las 7 muestras vegetales recolectas dentro de las
fechas programadas, en las provincias del Ecuador, a la altura descrita en metros sobre el nivel del
mar.
Nombre científico
Fecha de
recolección
Provincia
Cantón
Sobralia rosea
25/05/2023
Pastaza
Madre tierra
Sobralia sp.
01/07/2023
Napo
Mondayacu
Sobralia cf. virginalis
01/07/2023
Napo
Jodachi
Sobralia ecuadorana
08/08/2023
Santo Domingo
de los Tsáchilas
Alluriquìn
Sobralia pulcherrima
08/08/2023
Santo Domingo
de los Tzáchilas
Via alterna
Palo quemado
Sobralia ecuadorana
08/08/2023
Cotopaxi
Palo Quemado
Sobralia ecuadorana
09/08/2023
Cotopaxi
Pucayacu
El procesamiento del tejido vegetal se realizó en el Laboratorio de Ciencias de la Vida de la
Universidad Politécnica Salesiana.
Las hojas se lavaron con agua y jabón, se desinfectaron con alcohol de 70°GR, posteriormente se
lavaron con agua destilada y luego con hipoclorito de sodio, finalmente el último enjuague fue con
agua destilada.
El tejido vegetal se trasladó a bandejas para dejarlas secar al ambiente, luego se colocaron en fundas
con cierres herméticos debidamente etiquetadas y se llevaron a refrigeración a una temperatura de -
20°C hasta su utilización.
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Obtención de extractos hidroalcohólicos de Sobralia
Según la técnica descrita por (González & Horianski, 2018), las hojas fueron trituradas hasta obtener
un tamaño homogéneo y luego se pesaron en una balanza de precisión marca Radwag.
El proceso de extracción usado fue la maceración, la relación muestra vegetal y solvente de extracción
fue 1:3 (p/v) respectivamente y alcohol 70° GR como solvente, esta preparación se envaso en frascos
ámbar, los cuales permanecieron almacenados por 8 días a temperatura ambiente.
Transcurrido este tiempo, los macerados pasaron por filtración y concentrados en un rotavapor IKA
(RV-10 Basic) a una temperatura de 70°C, 60rpm y presión negativa hasta obtener una mezcla de
relación 1:1 de extracto concentrado.
Los extractos fluidos se almacenaron en envases ámbar y refrigeraron a -20°C hasta su utilización.
Ensayo de la actividad antibacteriana de los extractos fluidos por el método de disco-placa
Para el estudio de la actividad antimicrobiana de los 7 extractos obtenidos, se empleó el método de
disco-placa según la técnica descrita por (CLSI, 2018).
Obtención y activación de cepas
Se utilizaron cepas de: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomona aeruginosa ATCC 27853,
Salmonella typhi ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, que se obtuvieron del cepario
del Laboratorio de Ciencias de la Vida de la Universidad Politécnica Salesiana.
Cada una de las cepas estuvo etiquetada y aislada, de donde se tomó con un asa varias colonias y se
sembró con la técnica de estriado en cajas Petri con medio agar medio agar nutritivo marca DIFCO,
luego se llevaron a una incubadora marca memmert a 35 ± 2º C.
Preparación del inóculo y sembrado en cajas
El inóculo se preparó partiendo de una placa de cultivo de las bacterias en estudio, de 18 a 24 h de
incubación a 35 ± 2º C en agar nutritivo.
Se recogió varias colonias con un asa de siembra de platino y se realizó una suspensión de colonias
aisladas en 5 mL de solución fisiológica estéril, esta solución se agitó en un vórtex marca VM-300 de
15 a 20 segundos, hasta alcanzar visualmente a escala 0,5 McFarland.
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Posteriormente se midió la turbidez de dicha suspensión en un espectrofotómetro JASCO V-730 con
software Spectra Manager hasta obtener una absorbancia de 0,2000 a 625 nm dando un inoculo de 106
UFC/mL.
En el tubo del inóculo ajustado se introdujo un hisopo estéril, al retirarlo se rotó varias veces contra la
pared del tubo por encima del nivel del líquido para eliminar el exceso y se realizó la siembra del
inóculo en la superficie de la caja Petri con agar Mueller Hinton dejando secar por 3 minutos. En esta
misma caja, con una pinza estéril se colocó tres discos de celulosa estériles marca Oxoid Ltda, luego
los discos fueron impregnados con 10 uL de cada uno de los extractos.
Como control positivo se utilizaron discos de gentamicina (10 ug) marca Sensi-Disc. Posteriormente
se dejó reposar por 3 minutos y las cajas invertidas fueron trasladadas a una incubadora marca
memmert a 35 ± 2º C por 24 horas.
Ensayo de la Toxicidad
Este ensayo se realizó siguiendo la técnica descrita por (Saetama, 2018). Se utilizaron huevos de
Artemia Salina de la marca Mackay Marine.
Descapsulación
Se pesó 2 gramos de huevos de Artemia salina en la balanza de precisión marca Radwag, luego se
trasladó a un vaso de precipitación y se colocó 1 litro de agua destilada dejando reposar por 30
minutos.
Posteriormente a este vaso con Artemias, se agregó 50 mL de hipoclorito de sodio al 5% cada 3
minutos, hasta llegar a un volumen de 250 mL de solución de hipoclorito.
Con ayuda de un aireador de pecera marca JAD SC-7500 se burbujeó la solución por 3 minutos.
Finalmente se filtró la solución, se recuperó los huevos de Artemias y fueron enjuagadas con agua
destilada.
Incubación de huevos
Se cortó a la mitad una botella plástica de 3 litros en donde la tapa se utilizó como contenedor; en el
mismo se colocó 1500 mL de solución salina 2% con un pH de 8.0 ± 0.5, esta solución salina fue
sometida a aireación con un burbujeador marca JAD SC-7500 para mantener la oxigenación.
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En la solución aireada se colocaron los huevos de Artemia sin cápsula para ser incubados, después de
48 horas los nauplios se desarrollaron y los mismos fueron utilizados para las pruebas de toxicidad.
Preparación de la solución madre y llenado en las cajas Petri
Se preparó una solución patrón de 1000 ug/mL de extracto en etanol, el cual se dejó reposar durante
24 horas a temperatura ambiente para su evaporación, luego fue diluido para preparar las soluciones a
concentraciones de 5, 10, 25, 50 y 100 ug/mL, tomando de la solución patrón 25, 50, 125,250, 500 uL
respectivamente y luego se aforó a 5mL solución salina 2%.
En las cajas Petri con ayuda de una pipeta Pasteur se colocó 10 nauplios y luego se adicionó las
concentraciones de 5, 10, 25, 50 y 100 ug/mL en cada caja. Estas cajas fueron llevadas a incubación a
una cámara climática BINDER KBF 240 a 24°C durante 24 horas.
Conteo de nauplios muertos
Después de 24 horas se retiraron las cajas Petri con Artemias salinas y se realizó el conteo de número
de Artemias muertas en cada caja, utilizando un esteroscopio marca NIKON SMZ745. Se
consideraron los nauplios muertos al no observar ningún movimiento luego de transcurridos 10
segundos.
Concentración letal 50 (CL50) y grado de toxicidad
El porcentaje de mortalidad se calculó con la siguiente fórmula:
Para expresar el grado de toxicidad se utilizó la escala recomendada por CYTED (Ciencia y
tecnología para el desarrollo).
Tabla 2. Grado de toxicidad en base a CL50
CL50 (μg/mL)
Grado de toxicidad
1-10
Extremadamente tóxico
10-100
Altamente tóxico
100-500
Moderadamente tóxico
500-1000
Ligeramente tóxico
1000-1500
Prácticamente no tóxico
> 1500
Relativamente inocuo
Fuente: (Robles, 2016)
% Mortalidad = Individuos vivos pruebas −Individuos vivos control
Individuos vivos control 𝑥100
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Análisis Estadístico
Para el estudio de la actividad antimicrobiana se siguió un modelo experimental de 4x3x7 (4
microorganismos con 3 repeticiones para cada uno de los 7 extractos. Los resultados fueron
reportados como el promedio de los diámetros de inhibición en milímetros. Siendo 6 mm el diámetro
del disco de celulosa.
En el ensayo de toxicidad se siguió un diseño experimental de 5x7x3 (5 concentraciones de extracto,
7 extractos, 3 repeticiones).
La CL50 se calculó mediante análisis estadístico PROBIT (probabilidad + unit unidad) en el
programa Excel office 365, donde se partió del logaritmo de las concentraciones ensayadas: 5, 10, 25,
50 y 100 ug/ml, el porcentaje de mortalidad calculado y la tabla de transformación de porcentaje
PROBIT que arroja una ecuación con la intercepción y variable.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Obtención de extractos hidroalcohólicos de Sobralia
Se obtuvó 7 extractos correspondientes a 4 especies de orquídeas del género Sobralia. Los extractos
fluidos fueron preparados por maceración, a una concentración 1:1, de los cuales se detalla en la
Tabla 3.
Tabla 3. Especies identificadas, pesos de hojas, volumen recuperado y extracto concentrado. -
Nombre científico
Peso de
las hojas
(g)
Volumen de extracto
recuperado
(mL)
Volumen de extracto
concentrado
(mL)
Sobralia rosea
264,0
892
264
Sobralia sp.
126,2
479
126
Sobralia cf. virginalis
169,5
608
169
Sobralia ecuadorana
188,3
665
188
Sobralia pulcherrima
201,4
600
201
Sobralia ecuadorana
101,6
400
101
Sobralia ecuadorana
200,5
800
200
Extracto fluidos de las 7 muestras codificadas e identificadas, las hojas pesadas en gramos (g) y los
volúmenes de los extractos obtenidos medidos en mililitros (mL).
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Los extractos obtenidos presentaron ciertas características como: un color verde oscuro y una
consistencia ligera, inodora.
Para realizar los ensayos de actividad antibacteriana y toxicidad, se obtuvo aproximadamente 200
gramos de tejido vegetal que corresponden a 200ml de volumen extracto.
(Benítez, y otros, 2020) reporta que para la obtención del extracto etanólico por maceración el mejor
tiempo es de 48 horas, usando material vegetal molido y con aplicación de agitación.
En este estudio se utilizaron hojas frescas y trituradas, lo cual podría haber influido en la extracción
de los componentes activos de las muestras de Sobralia.
Ensayo de actividad antibacteriana
Los extractos fueron evaluados para determinar la actividad antimicrobiana frente a las bacterias
E.coli, P.aeruginosa, S.aureus y S.typhi, mediante el método de disco-placa.
La actividad antimicrobiana de los 7 extractos de Sobralia se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. Extractos de Sobralia vs Bacterias. -
Bacterias estudiadas
Media del diámetro de halos de inhibición (mm)
Especie
E. coli
P. aeruginosa
S.typhi
S. aureus
S.rosea
6,00
6,00
6,00
6,00
S.sp
15,00
8,67
11,67
12,00
S.cf.virginalis
12,33
6,00
11,67
12,33
S.ecuadorana
9,33
9,67
9,00
9,67
S.pulcherrima
7,00
6,00
7,67
6,00
S.ecuadorana
8,67
9,00
8,00
12,00
S.ecuadorana
7,67
9,67
8,33
9,67
Gentamicina 10µg
Control positivo
21,00
18,67
19,67
24,11
Efecto de inhibición de crecimiento de los 7 extractos de Sobralia para la cantidad 10mg frente a
bacterias E.coli, P.aeruginosa, S.aureus y S.typhi por el método de disco placa, los valores
representan el promedio del diámetro del halo generado medidos en mm (milímetros).
En la Fig 1 se puede apreciar que Sobralia sp presentó actividad antibacteriana frente E.coli,
presentando un halo de inhibición de 15 mm, lo cual según la norma M100 entra en la categoría de
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sensible. Sin embargo para las placas con S.aureus y S.typhi mostraron sensibilidad intermedia con
halos de 12 mm. Por otro lado Sobralia cf. virginalis presentó sensibilidad intermedia frente E.coli,
S.aureus y S.typhi los halos de inhibición fueron de 12 mm.
Sobralia ecuadorana tiene sensibilidad intermedia frente a S.typhi presentando halos de inhibición de
12 mm. Sobralia rosea y Sobralia pulcherrima no tiene actividad antibacteriana ya que presentaron
halos de 6 mm a 9 mm frente a E.coli, P.aeruginosa S.aureus y S.typhi.
Como discusión del estudio, Sobralia sp, obtuvo resultados similares a lo descrito con (Arora, 2017),
que encontró que el extracto etanólico de los pseudobulbos de Crepidium acuminatum obtuvieron
halos de 15 mm frente a E. coli.
En otro estudio (Ranjitha, 2016), reporta que el extracto metanólico de Coelogyne nervosa exhibió
una marcada actividad antibacteriana frente S.aureus con un halo de 21 mm, y halos de 18 mm para
P.aeruginosa, E. coli respectivamente.
Figura 1. Antibiograma-Disco placa- Sobralia frente a E.coli
Placas con medio Muller Hinton y bacteria E.coli de las tres repeticiones ensayadas, Extractos: 1.
Sobralia rosea; 2. Sobralia spp; 3. Sobralia rosea; C+ Control positivo Gentamicina 10μg.
Fig 7.- Antibiograma-Difusión en disco-agar-
Sobralia frente a E.coli
Placas con medio Muller Hinton y bacteria
E.coli, Extractos: 1. Sobralia rosea; 2.
Sobralia spp; 3. Sobralia rosea; C+ Control
positivo Gentamicina 10μg.
1
2
C+
3
1
1
2
3
C+
3
2
C+
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Ensayo de toxicidad
Los 7 extractos fueron evaluados para determinar a qué concentración producen un efecto tóxico
sobre Artemias salinas, causando la muerte del más 50% de los organismos, obteniendo un valor de
CL50 a las 24 horas.
Los resultados de este estudio se interpretaron de acuerdo con la escala recomendada por (Robles,
2016) siendo los siguientes:
De acuerdo con el grado de toxicidad, Sobralia pulcherrima es altamente toxica con un CL50 fue de
81,73μg/mL. Mientras que Sobralia sp y Sobralia ecuadorana son moderadamente toxicas ya que la
CL50 se encuentran dentro del rango de 100 a 200 μg/mL.
Sobralia rosea según el grado de toxicidad es ligeramente tóxica con un CL50 de 567,82 μg/mL.
Sobralia cf. virginalis es relativamente inocua ya que tiene un CL50 2459,61 μg/mL.
Dentro de la discusión de los resultados se encontró que son similares con lo reportado por (Muñoz,
2019) donde Cattleya warscewiczii es moderadamente tóxica, los valores de CL50 en raíz fueron de
85.27 ppm, 211.37ppm para bulbos y 344.17 ppm en hojas.
En otro estudio (Agustini, 2020) reporta que el extracto en etanol la especie Dendrobium lasianthera,
es ligeramente tóxico ya que obtuvo un CL50 de 699,3 ppm.
(Aranda & Villacrés, 2019) mencionan que cuando un extracto de planta es altamente toxica, se
debería a sus compuestos bioactivos (polifenoles) por lo que podrían tener un potencial efecto
antitumoral y la muestra clasificada como inocua, indicaría que pueden ser bien tolerada por sistemas
biológicos.
Tabla 5. Determinación de CL50 de los extractos de Sobralia. -
Especie
Concentración µg/mL
Grado de toxicidad
S. rosea
567,82
Ligeramente tóxico
S. sp
209,63
Moderadamente tóxico
S. cf. virginalis
2459,61
Relativamente inocuo
S. ecuadorana
115,70
Moderadamente toxico
S. pulcherrima
81,73
Altamente toxico
S. ecuadorana
100,68
Moderadamente toxico
S. ecuadorana
104,16
Moderadamente toxico