DETECCIÓN MOLECULAR CON LA TÉCNICA
DE PCR EN UN SOLO PASO PARA EHRLICHIA CANIS EN
PERROS DEL CANTÓN PONCE ENRÍQUEZ, ECUADOR
MOLECULAR DETECTION OF EHRLICHIA CANIS USING
ONE-STEP PCR TECHNIQUE IN DOGS FROM PONCE
ENRÍQUEZ CANTON, ECUADOR
Mvz. Silvia Vásquez Borja
Universidad Técnica de Machala, Ecuador
Mvz. Fernando L. Aguilar Gálvez
Universidad Técnica de Machala, Ecuador
Mvz. Ana E. Guerrero López
Universidad Técnica de Machala, Ecuador
Ing, Agr. Brian Juvenal Mocha Cuenca
Universidad Técnica de Machala, Ecuador
Mvz. Miluska Vanessa Baylòn Cuba
Universidad Técnica de Machala, Ecuador
Mvz. Robert G. Sánchez Prado
Universidad Técnica de Machala, Ecuador
pág. 8018
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v8i2.11234
Detección Molecular con la Técnica de PCR en un solo Paso para Ehrlichia
Canis en Perros del Cantón Ponce Enríquez, Ecuador
Mvz. Silvia Vásquez Borja1
scvasquezb_est@utmachala.edu.ec
https://orcid.org/0009-0008-9233-6834
Universidad Técnica de Machala
Ecuador
Mvz. Fernando L. Aguilar Gálvez
flaguilar@utmachala.edu.ec
https://orcid.org/0009-080048004
Universidad Técnica de Machala
Ecuador
Mvz. Ana E. Guerrero López
anitaguerrero19@gmail.com
https://orcid.org/0000-0001-6081-9163
Docente Universidad Técnica de Machala
Ecuador
Ing, Agr. Brian Juvenal Mocha Cuenca
bmocha@utmachala.edu.ec
https://orcid.org/0000-0002-5989-7516
Universidad Técnica de Machala
Ecuador
Mvz. Miluska Vanessa Baylòn Cuba
mbaylonc@iest24dejuliodezarumilla.edu.pe
https://orcid.org/0000-0003-1103-345X
Instituto de Educación Superior Tecnológico
24 de Julio de Zarumilla
Perú
Mvz. Robert G. Sánchez Prado
rgsanchez@utmachala.edu.ec
https://orcid.org/0000-0002-1611-8201
Universidad Técnica de Machala
Ecuador
RESUMEN
La Ehrlichiosis es una enfermedad infecciosa transmitida por garrapatas en perros y otros cánidos, es
causada por Ehrlichia canis (E. canis) y su diagnóstico es fundamental para su manejo clínico y control
de la patología. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ha demostrado ser una herramienta
eficaz para la detección molecular de E. canis, permitiendo una identificación específica y sensible de
la bacteria en perros infectados. Este estudio fue diseñado para detectar la presencia de E. canis
utilizando el método de diagnóstico molecular por PCR en un solo paso, considerando las posibles
variantes moleculares que pueden surgir. El resultado evidencio que de 120 pacientes caninos
sintomáticamente compatibles con E. canis, 45 resultaron positivos al kit de Inmunocromatográfia
(45/145), dando una prevalencia de 37,5% de positividad a la presencia de anticuerpos a E. canis. Y la
amplificación por PCR utilizando cebadores específicos para E. canis se dio en 14 animales del total de
45 positivos a IC, con tasa de infección del 31,11%, con un amplicón de 409 pb como producto final.
Los valores encontrados en la tasa de infección de E. canis con relación a la edad, sexo y raza no fueron
significativos (p-valor >0.005), al no encontrar diferencias podemos indicar que estas condiciones no
afectan de ninguna forma la incidencia de la enfermedad y su positividad. Este estudio logró confirmo
la presencia de la bacteria en los animales muestreados por medio de PCR en un solo paso y propone la
implementación de esta técnica como herramienta diagnóstica en la ciudad.
Palabras claves: PCR, caninos, Ehrlichia canis, molecular
1
Autor principal
Correspondencia: scvasquezb_est@utmachala.edu.ec
pág. 8019
Molecular Detection of Ehrlichia Canis Using One-Step PCR Technique in
Dogs from Ponce Enríquez Canton, Ecuador
ABSTRACT
Ehrlichiosis is a tick-borne infectious disease in dogs and other canids, caused by Ehrlichia canis (E.
canis), and its diagnosis is crucial for clinical management and disease control. Polymerase Chain
Reaction (PCR) has proven to be an effective tool for the molecular detection of E. canis, allowing
specific and sensitive identification of the bacteria in infected dogs. This study was designed to detect
the presence of E. canis using the one-step PCR molecular diagnostic method, considering possible
molecular variants that may arise. The results showed that out of 120 symptomatic canine patients
compatible with E. canis, 45 tested positive for the Immunochromatographic (IC) kit (45/145), yielding
a prevalence of 37.5% positivity for E. canis antibodies. PCR amplification using specific primers for
E. canis was observed in 14 animals out of the total 45 positive for IC, with an infection rate of 31.11%,
yielding a 409 bp amplicon as the final product. The values found in the E. canis infection rate
concerning age, sex, and breed were not significant (p-value >0.005). As no differences were found, we
can indicate that these conditions do not affect the incidence of the disease and its positivity. This study
confirmed the presence of the bacteria in the sampled animals using one-step PCR and proposes the
implementation of this technique as a diagnostic tool in the city.
Keywords: PCR, canines, Ehrlichia canis, molecular
Artículo recibido 28 marzo 2024
Aceptado para publicación: 30 abril 2024
pág. 8020
INTRODUCCION
La Ehrlichiosis es una enfermedad infecciosa importante transmitida por garrapatas en perros y otros
cánidos, con mayor frecuencia en regiones tropicales y subtropicales. La Ehrlichiosis es causada por
Ehrlichia canis (E. canis), bacterias gramnegativas obligadas que infectan monocitos, granulocitos y
plaquetas (Abdelfattah y col., 2019). El diagnóstico preciso de esta enfermedad es fundamental para su
manejo clínico y control. En este contexto, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ha
demostrado ser una herramienta eficaz para la detección molecular de E. canis, permitiendo una
identificación específica y sensible de la bacteria en muestras clínicas de perros infectados (Lapo, 2022;
Gutiérrez y col., 2022). Los ensayos por IFI son considerados el estándar de oro para el diagnóstico de
CME y HME, pero éstos no pueden diferenciar anticuerpos contra las diferentes especies de Ehrlichia,
ya que se ha reportado reactividad cruzada entre E. canis, E chaffeensis y E. ewingii, así como con
Anaplasma phagocytophilum, pudiendo generar falsos positivos y ocasionar que el agente etiológico de
la infección no sea determinado (Franco y Col.,2019). El valor de sensibilidad de esta prueba dependerá
de las semanas transcurridas desde el inicio de la infección, teniendo valores entre 82 y 100%, mientras
que, la especificidad, oscila entre 67 y 100% debido a la reactividad cruzada que se presenta (Franco y
col.,2019). De igual manera, estos dos parámetros pueden variar con base en la composición de los
antígenos utilizados, así como el formato de la prueba, ya que utilizar proteínas recombinantes,
sintéticas o microorganismos completos provenientes de cultivo, puede causar diferencias en la
reactividad antígeno-anticuerpo afectando los valores de sensibilidad y especificidad (Franco y
col.,2019). Las PCRs anidadas mejoran la especificidad y sensibilidad del ensayo de PCR para Ehrlichia
spp. (Dawson y col., 1996, Breitschwerdt y col, 1998, Murphy y col., 1998). En la PCR anidada
cebadores géneros específicos se utilizan en la primera reacción para detectar ADN Ehrlichial, mientras
que los cebadores especie específicos se utilizan en la segunda reacción para diferenciar entre las
distintas especies (Kelly, 2000). En la PCR de un solo paso se ha utilizado cebadores que permiten la
amplificación de todas las especies de Ehrlichia provenientes de muestras de sangre y tejidos (Iqbal y
col., 1994). La variabilidad genética de Ehrlichia canis es un aspecto crucial a considerar en el
diagnóstico molecular, ya que diferentes regiones geográficas pueden albergar variantes genéticas
específicas de la bacteria. Estas variantes moleculares pueden influir en la eficacia de las pruebas de
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PCR y en la interpretación de los resultados. Por lo tanto, es fundamental investigar y comprender las
posibles variantes moleculares de E. canis presentes en una región determinada para mejorar la
precisión del diagnóstico y la comprensión de la epidemiología de la Ehrlichiosis canina (Aragón y col.,
2021; Castro, 2012). En esta publicación científica, se abordó la importancia del diagnóstico molecular
por PCR de Ehrlichia canis, considerando las posibles variantes moleculares que pueden surgir en una
región específica. Se analizo la relevancia de la detección precisa de estas variantes genéticas para
mejorar la eficacia del diagnóstico y la comprensión de la diversidad genética de E. canis en el contexto
de la Ehrlichiosis canina.
METODOLOGIA
Recolección y procesamiento de las muestras para inmunocromatográfica Kit -test (IC)
Para el presente estudio se seleccionó un total de 120 muestras de perros que llegaron a consulta a la
veterinaria “Hervás” del cantón Camilo Ponce Enríquez (Ecuador), los mismos que presentaban
sintomatología clínica compatible con Ehrlichiosis canina y además presentaban antecedentes de
garrapatas. Las muestras de sangre se obtuvieron desde la vena cefálica y las misma fueron transferidas
rápidamente a un tubo con EDTA, homogeneizadas y conservadas a temperatura ambiente hasta su
utilización. Inmediatamente extraídas las muestras se aplicó el Test kit de inmunocromatografia
SensPERT (CHW Ag/Anaplasma Ab /E. Canis Ab/Lyme Ab - VetAll Laboratories, Corea Del Sur).
Todas las muestras positivas a IC fueron sometidas a PCR convencional en un solo paso.
Detención molecular del ADN de E. Canis
El ADN fue extraído del plasma sanguíneo de los perros examinados utilizando el kit comercial de
extracción de ADN (Quick- DNA Microprep w/ Zymo Spin, Irvine, EUA) siguiendo las instrucciones
del fabricante. El ADN extraído se almaceno a -20 °C hasta su posterior uso en el ensayo de PCR. Se
llevo a cabo una prueba de PCR dirigido al gen 16S rRNA de E. canis utilizando pares específicos de
cebadores en todas las muestras de sangre para detectar la presencia de E. canis. La reacción de PCR
se llevó a un volumen final de 25 µl. En donde la mezcla se realizó utilizando 0,6 µl del primer forward
(CANIS 5′-CAA-TTA-TTT-ATA-GCC-TCT-GGC-TAT AGG-A-3′), 0,6 µl del primer reverse (GA1UR
5′-GAG-TTT-GCC-GGG-ACT-TCT-TCT-3`) a una concentración de 100 pmol/μl, 6,3 µl de H2O µl y
12,5 µl de Taq 2X PCR Master Mix (abm, Canadá) y finalmente se agregó 5,0 µl de ADN templado. El
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procedimiento del termo ciclado fue el siguiente: 1 ciclo de 5 min a 95 ºC, 40 ciclos de 30 sec a 95 ºC,
30 sec a 62 ºC, luego 1 ciclo de 1 min a 72ºC y finalmente 1 ciclo de 5 min a 72º C. Para la visualización
del resultado de PCR amplificados se realizó en gel de agarosa al 1.5 %, se utilizó un marcador de peso
molecular de 100 pb.
Análisis estadístico
Todos los datos fueron manejados en hojas de cálculo de Microsoft Excel 2016. Y se utilizó la prueba
de ji-cuadrado con una confiabilidad del 95 %, utilizando el software estadístico SPSS versión 22, para
probar la importancia de la seroprevalencia y diferencias regionales, con p < 0,05 como nivel mínimo
de significación estadística.
RESULTADOS Y DISCUSION
El resultado evidencio que a partir de 120 pacientes caninos sintomáticamente compatibles con
Ehrlihiosis canina, 45 animales resultaron positivos al kit de inmunocromatografia (45/145), dando una
prevalencia de 37,5% de positividad a la presencia de anticuerpos a E. canis. Se demostró la
amplificación por PCR utilizando cebadores específicos para E. canis en 14 animales de un total de 45
positivos a IC, dando una tasa de infección del 31,11%, con un amplicón de 409 pb de producto final
como se muestra en la figura 1 (A/B).
Figura 1
(A) Amplificación del gen 16S rRNA a partir del ADN de algunos perros examinados, aproximadamente 409 pb. Carril 1-3
muestras positivas (409 pb); carril 4 muestra negativa; marcador molecular (carril M); carril 5 -6 muestras positivas (409 pb)
y carril CN control negativo. (B) El carril 1 y 2 muestran el producto obtenido con lo cebadores CANIS 5´ y GA1UR para E.
canis ; el carril M muestra la escalera de 100 pb de marcador molecular y el carril CN el resultado de la mezcla sin añadir ADN
molde.
A
B
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Los valores encontrados en la tasa de infección de E. canis con relación a la edad, sexo y raza no fueron
significativos (p-valor >0.005), lo cual no encontrar diferencias podemos indicar que estas condiciones
no afectan de ninguna forma la incidencia de la enfermedad y su positividad. Sin embargo, resultados
obtenidos para la detección de ehrlichiosis en diferentes razas, demostraron que E. canis puede infectar
a todas las razas de perros, pero una mayor tasa de infección en las razas alemanas en comparación a
otras razas (Abdelfattah y col., 2019). Por otra parte (Cañar y col., 2023) reportaron en un estudio de
PCR, una tasa de incidencia mayor en caninos mestizos. Martínez y col., (2015) en Venezuela indicaron
que el análisis serológico en busca de anticuerpos IgG anti – E. canis de 110 pacientes muestreados
presentaron 85 muestras positivas con un (77,3%) de prevalencia, corroborando con datos similares se
presenta Rivas y col.,2010, en Nicaragua donde realizaron un estudio de 27 muestras de un ensayo de
IC, obteniendo un total de 17 animales positivos (63%). Datos diferentes en estudios de IC se
presentaron en Lima – Perú, quienes indicaron que, de un total de 1216 animales muestreados, 723
pacientes dieron positivos E. canis 59,4% (Cusicanqui, J y Zuñiga R, 2020), estos resultados
demuestran la aplicabilidad de la prueba de IC en investigación diagnóstica veterinaria para E. canis.
La presencia de Ehrlichiosis ha sido detectada y reportada en perros en diferentes partes de
Latinoamérica con prevalencias similares a las encontradas en este estudio como la de Colombia con
un 33,3% (Bonilla y col., 2012). En el Ecuador existen muy pocos trabajos publicados sobre diagnóstico
molecular de E. canis y dándole principal consideración por tratarse de una enfermedad con capacidad
de coinfección con otros tipos de patógenos (Chalco y col., 2023). Estudios confirmaron la sensibilidad
de la PCR y las limitaciones de pruebas de diagnóstico como exámenes microscópicos e IC
diagnósticos. Trabajos realizados en otras localidades hacen referencia de la sensibilidad del PCR, como
lo indica (Cañar y col., 2023), en donde de 24 pacientes analizados por PCR, 18 muestras dieron
positivas a E. canis (52,94%) y (Rodríguez y col., 2020) en la ciudad de México con 28 pacientes de
resultados positivos a E. canis mediante PCR con un 47,45%.
CONCLUSIONES
El presente estudio confirma la presencia de E. canis entre los perros del cantón Ponce Enríquez
(Ecuador), La implementación de la PCR en un solo paso para el diagnóstico de la Ehrlichiosis Canina
se realizó con éxito en el presente trabajo y se propone esta técnica como prueba confirmatoria para el
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diagnóstico de la enfermedad en nuestros pacientes. Así mismo se recomienda realizar encuestas
epidemiológicas de la patologia en otras localidades para planificar medidas de control de la enfermedad
entre los perros. Y se debe tener en consideración la necesidad de estudios adicionales para la
tipificación molecular y el análisis filogenético de la bacteria E. canis.
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