pág. 8503
CONSTRUCCIÓN EN Escherichia coli DEL
PLÁSMIDO pamea2 QUE CONTIENE EL GEN
csra DE Bacillus licheniformis M2-7
CONSTRUCTION IN Escherichia coli OF THE pamea2 PLASMID
CONTAINING THE csra GENE OF Bacillus licheniformis M2-7
America Yaret Bello Mendoza
Universidad Autónoma de Guerrero, México
José Alberto Hernández Eligio
Universidad Autónoma de México, México
Alejandro Bolaños Dircio
Universidad Autónoma de Guerrero, México
Yanet Romero Ramírez
Universidad Autónoma de Guerrero, México
Augusto Rojas Aparicio*
Universidad Autónoma de Guerrero, México
pág. 8504
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v8i2.11618
Construcción en Escherichia coli del Plásmido pAmeA2 que Contiene
el Gen csrA de Bacillus licheniformis M2-7
America Yaret Bello Mendoza1
16279970@uagro.mx
https://orcid.org/0009-0001-3142-8419
Universidad Autónoma de Guerrero
México
José Alberto Hernández Eligio
alberto.hernandez@ibt.unam.mx
https://orcid.org/0000-0002-2787-8732
Universidad Autónoma de México
México
Alejandro Bolaños Dircio
alexo_guerrero@hotmail.com
https://orcid.org/0000-0003-1638-3870
Universidad Autónoma de Guerrero
México
Yanet Romero Ramírez
yanetromero7@gmail.com
https://orcid.org/0000-0002-8383-4128
Universidad Autónoma de Guerrero
México
Augusto Rojas Aparicio
rojas9101@gmail.com
https://orcid.org/0009-0004-4269-4589
Universidad Autónoma de Guerrero
México
RESUMEN
Actualmente el uso de los hidrocarburos aromáticos policíclicos se ha asociado a la contaminación
de la flora y fauna, repercutiendo sobre la salud humana. Para corregir esta problemática, se han
desarrollado métodos de biorremediación basados en la aplicación de microorganismos capaces
de restaurar ambientes contaminados con este tipo de hidrocarburos. Uno de los modelos
bacterianos utilizados es la cepa de Bacillus licheniformis M2-7, que tiene la capacidad de
degradar HAPs. Esto lo lleva a cabo a partir del sistema Csr, que contiene el gen csrA que codifica
para la proteína CsrA, asociada a la motilidad y capacidad de utilizar hidrocarburos como fuente
de carbono. La presente investigación tuvo como objetivo la construcción del plásmido que
contiene el gen csrA de B. licheniformis M2-7. Para ello se caracterizó in silico el gen csrA, se
realizó la extracción del ADN de B. licheniformis M2-7 y la amplificación del gen csrA por PCR.
El gen fue clonado en el vector pJET1.2/Blunt para la construcción del plásmido. Se
transformaron y seleccionaron a las cepas de E. coli, para posteriormente confirmar la presencia
de csrA por PCR, digestión enzimática y secuenciación. Se logró construir y confirmar la
presencia del plásmido pAmeA2.
Palabras clave: Bacillus licheniformis M2-7, csrA, plásmidos, HAPs
1
Autor principal
Correspondencia: rojas9101@gmail.com
pág. 8505
Construction in Escherichia coli of the pAmeA2 Plasmid Containing
the csrA Gene of Bacillus licheniformis M2-7
ABSTRACT
Currently, the use of polycyclic aromatic hydrocarbons has been associated with the
contamination of flora and fauna, affecting human health. To correct this problem, bioremediation
methods have been developed based on the application of microorganisms capable of restoring
environments contaminated with this type of hydrocarbons. One of the bacterial models used is
the Bacillus licheniformis M2-7 strain, which has the capacity to degrade PAHs. This is carried
out by the Csr system, which contains the csrA gene that codes for the CsrA protein, associated
with motility and the capacity to use hydrocarbons as a carbon source. The present investigation
was aimed at constructing the plasmid containing the csrA gene of B. licheniformis M2-7. For this
purpose, the csrA gene was characterized in silico, the DNA of B. licheniformis M2-7 was
extracted and the csrA gene was amplified by PCR. The gene was cloned into the pJET1.2/Blunt
vector for plasmid construction. E. coli strains were transformed and selected, and the presence
of csrA was confirmed by PCR, enzymatic digestion and sequencing. The presence of the plasmid
pAmeA2 was constructed and confirmed.
Keywords: Bacillus licheniformis M2-7, csrA, plasmids, PAHs
Artículo recibido 11 marzo 2024
Aceptado para publicación: 12 abril 2024
pág. 8506
INTRODUCCIÓN
Bacillus licheniformis M2-7 es una bacteria anaerobia facultativa y termorresistente, con un rango
de temperatura de crecimiento de 37 a 60°C y puede resistir temperaturas de 110°C (Guavara-
Luna et al., 2022). Se ha demostrado que B. licheniformis M2-7 utiliza hidrocarburos como
gasolina y gasóleo, como única fuente de carbono (Guavara-Luna et al., 2022), también puede
crecer en presencia de Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs), como naftaleno,
fenantreno, pireno y benzo[a]pireno (Guavara-Luna et al., 2018; Rojas-Aparicio et al., 2018) y se
ha reportado que esta cepa utiliza el Sistema Regulador de Almacenamiento de Carbono (Csr, por
sus siglas en inglés) como mecanismo para degradar hidrocarburos (Serrano-Ángel et al., 2020;
Blancas et al., 2023). El sistema Csr es un regulador global de diversos procesos celulares
(Vakulskas et al., 2015), en varias especies de bacterias Gramnegativas (Lawhon et al., 2003), es
un complejo de unión al ARN que se encarga de regular la expresión génica a nivel
postranscripcional, afectando la unión al ribosoma y/o a la estabilidad de los ARNm blancos
(Yakhnin et al., 2007; Edwards et al., 2011). El sistema Csr está conformado por dos
componentes, CsrA y CsrB (Leng et al. 2015; Vakulskas et al., 2015); CsrA es el componente
clave del sistema Csr, es una proteína de 61 aminoácidos (Romeo, 1998), en dímero se une al
ARNm blanco (Pourciau, et al., 2020). Por otro lado, CsrB es una pequeña molécula de ARN no
codificante de 360 pares de bases, dentro de su estructura contiene 18 sitios o secuencias consenso
que reconoce CsrA (Romeo, 1998). El sistema Csr no ha sido tan estudiado en bacterias Gram
positivas, en Bacillus subtilis, el gen csrA está ubicado en el operón de la biosíntesis flagelar y
antes del gen hag; el cual es responsable de codificar la proteína flagelina. CsrA tiene la función
de unirse a dos sitios de la región 5´ de hag para reprimir la expresión de la proteína (Yakhnin et
al., 2007), funcionando como control morfogénico en el ensamblaje flagelar (Babitzke & Romeo,
2007). CsrA afecta positivamente a la motilidad pese a tener un efecto inhibidor sobre la expresión
de hag (Yakhnin et al., 2007). Para demostrar la función del gen csrA en Bacillus licheniformis
M2-7, se diseñó y construyó la cepa mutante LYA-5, que presenta el bloqueo de csrA por medio
de la inserción de un cassette de resistencia a espectinomicina (Serrano-Ángel et al., 2020). Se
demostró que el gen csrA juega un papel fundamental en la degradación de gasolina, observando
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que la expresión relativa de este gen aumenta 2 veces a las 6 horas y hasta 29 veces a las 12 horas
de incubación con gasolina al 0.2% con respecto a la cepa silvestre. Además, se reportó que el
gen csrA regula la expresión del gen hag que codifica para la síntesis de flagelina y está
relacionado con movilidad de la bacteria, al igual que ocurre en B. subtilis (Serrano-Ángel et al.,
2020). En la actualidad los hidrocarburos forman parte de la vida cotidiana de miles de personas
alrededor del mundo, por lo que la diseminación de estos en diferentes ecosistemas ha ido
incrementando, contaminando severamente al agua, aire y suelo (Patel et al., 2020). Para atenuar
el problema se ha implementado el uso de técnicas físicas, químicas y biológicas, estas últimas
involucran el uso de microorganismos en procesos de biorremediación (Elenga-Wilson et al,
2021). Uno de los géneros utilizados en la aplicación biotecnológica ha sido Bacillus, en ese
sentido, B. licheniformis M2-7 es un importante microrganismo que ha demostrado utilizar
diferentes hidrocarburos como única fuente de carbono, y se ha comprobado que el sistema Csr
tiene una participación importante en la regulación del consumo de esta fuente de carbono. La
cepa LYA-5, se ha considerado como candidata para aplicar en procesos de degradación de
hidrocarburos, sin embargo, es importante confirmar que el efecto de este proceso se debe a la
inactivación del gen csrA, por ello el objetivo de esta investigación es realizar el diseño y la
construcción del plásmido pAmeA2, el cual lleva el gen csrA y podrá ser utilizado, en un futuro,
para la expresión heteróloga del gen csrA en la cepa mutante de B. licheniformis LYA-5,
restaurando el fenotipo de la cepa silvestre. Esto contribuirá a comprender la degradación de
hidrocarburos y permitirá involucrar al sistema Csr para el diseño de nuevos microorganismos o
estrategias de biorremediación.
METODOLOGÍA
Se realizó un estudio de tipo experimental en el Laboratorio de Microbiología Molecular y
Biotecnología Ambiental de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas, perteneciente a la
Universidad Autónoma de Guerrero; se utilizó como criterio de selección al plásmido
pJET1.2/Blunt, la cepa de Bacillus licheniformis M2-7 para la extracción del gen csrA y la cepa
de Escherichia coli MC1061. Para este trabajo se tuvo como variable de exposición el diseño y
construcción del plásmido, así como la transformación de la cepa E. coli; como variable de
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respuesta se tuvo la presencia del plásmido pAmeA en el citoplasma de E.coli, y el crecimiento
de las células transformantes en medio suplementado con ampicilina. Además, se trabajó bajó las
normas NOM-052-SEMARNAT-2005 y NOM-087-ECOL-SSA1-2002.
Condiciones de cultivo de las cepas utilizadas durante el proyecto
Las cepas utilizadas en este trabajo fueron Bacillus licheniformis M2-7 y Escherichia coli
MC1061 las cuales se cultivaron en medio nutritivo Luria Bertani (LB), composición en g/L:
peptona de caseína 10, extracto de levadura 5, cloruro de sodio 10, para medio líquido
(suplementado con 15 de agar bacteriológico para medio solido) y se mantuvieron a 37 °C por
16-24 h. Las cepas de E. coli AmeA, se cultivaron en medio LB, suplementado con ampicilina a
una concentración de 200 ug/ml.
Análisis in silico de la secuencia del gen csrA y diseño del plásmido
El análisis de la secuencia del gen csrA se realizó a partir de la plataforma bioinformática Gene
& Genome del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se analizó la secuencia
nucleotídica de la cepa de referencia de Bacillus licheniformis DSM13=ATCC 14580. Para el
análisis de la proteína y la búsqueda de dominios conservados, se utilizaron los repositorios y
bases de datos como: Conserved Domain, de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Uniprot
(https://www.uniprot.org), Pfam-InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) y Ensembl Bacteria
(https://bacteria.ensembl.org/index.html). Para la generación de los oligonucleótidos se utilizó el
programa Primer3 (https://primer3.ut.ee/), aquí se tomaron en cuenta las condiciones y buen
funcionamiento de estos. A partir de este análisis, se logró realizar el diseño del programa de
Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reactión, PCR) considerando la
temperatura de alineamiento de los oligonucleótidos y el tiempo de elongación del gen csrA. El
diseño del plásmido se realizó mediante el Software SnapGene (https://www.snapgene.com/).
Amplificación del gen csrA de Bacillus licheniformis M2-7
Se extrajo el ADN genómico de un cultivo de 16 h de Bacillus licheniformis M2-7 mediante el
kit Quick-DNA fungal/bacterial miniprep (Zymo research), siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se cuantificó el ADN extraído mediante NanoDrop (Thermo Fisher Scientific), se
analizó en gel de agarosa al 1 % (SIGMA) y se visualizó su integridad en transiluminador. El
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ADN genómico sirvió para poder realizar la amplificación por PCR de la región codificante del
gen csrA, utilizando los oligonucleótidos CsrAMFw 5´CTAGTCTTATCCCGCAAG3´ y
CsrAMRw 5´CTTTTTTTGTGAGGATAA3´. Para la reacción se utilizaron 50 ng de ADN
genómico, 2.5 uL buffer 10X, 2 uL de MgCl2 20 mM, 2 uM de cada dNTP, 1 U de ADN Taq-
polimerasa y agua libre de nucleasas en un volumen final de 25 uL. Las condiciones usadas
fueron: desnaturalización inicial de 5 min a 95 °C; 30 ciclos de: desnaturalización por 30 s a 95
°C, alineamiento de 30 s a 51 °C, extensión de 30 s a 72 °C; y un ciclo final a 72 °C por 10 min.
El producto de PCR se analizó en un gel de agarosa al 1% utilizando tampón TAE (Tris-Ácido-
EDTA) con 10 ng/mL de bromuro de etidio y se visualizó bajo luz ultravioleta (UV).
Ligación del producto de PCR al plásmido pJET1.2/Blunt
Para la obtención del plásmido pAmeA, el producto de PCR se clonó en el plásmido
pJET1.2/Blunt bajo el protocolo establecido por el kit comercial CloneJET PCR Cloning. Para la
clonación del plásmido pAmeA, se realizó la transformación de células competentes de E. coli
MC1061, utilizando la técnica de choque térmico (Sambrook J. & Russell W., 2001). Para ello se
adicionaron 20 uL de la reacción de ligación en 100 uL de las células competentes de E. coli
MC1061 y la selección de transformantes se realizó utilizando 100 uL de la reacción en placas de
LB suplementadas con 200 ug/mL de ampicilina. Las células transformantes se colocaron en
incubación por 16 h a 37 ° C.
Extracción de ADN plasmídico y confirmación del plásmido pAmeA
De las células transformantes candidatas se realizó la extracción de los ADN plasmídico,
utilizando el kit GeneJET Plasmid Miniprep kit siguiendo el protocolo del fabricante (Thermo
Scientific). Los plásmidos se analizaron en un gel de agarosa al 1%, se visualizaron en
transiluminador y se cuantificaron. Se realizó la confirmación de los plásmidos mediante una PCR
punto final del gen csrA directamente de colonia y utilizando ADN plasmídico.
Secuenciación del gen csrA en el plásmido pAmeA
Una vez confirmados los plásmidos por PCR, se realizó la secuenciación del gen csrA para
corroborar la inserción de este en el plásmido de clonación y su orientación, para ello, se preparó
en un microtubo de 0.6 uL, un volumen final de 16 µL, con una concentración de 10 µM
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(pmol/µL) de oligonucleótidos utilizados (CsrAMFw y CsrAMw) y 100 ng/uL de producto de
plásmido pAmeA. La secuencia fue analizada con el programa DNA Baser Assembler, mientras
que para el alineamiento de la secuencia se utilizó la herramienta Blast-NCBI usando como
genoma de referencia a B. licheniformis ATCC DSM 13 = ATCC 14580.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis in silico y arreglo genético del gen csrA
Se seleccionó y utilizó el genoma de referencia de B. licheniformis ATCC DSM 13 = ATCC
14580, determinando que este posee un total de 4,27832 Mb, 4382 genes y 4219 proteínas.
Posteriormente se realizó el análisis bioinformático del gen csrA, el cual arrojó su arreglo
genético, indicando que se ubica entre los genes fliW y hag (Fig. 1), los cuales tienen una
importancia en el metabolismo celular, para la obtención de diferentes fuentes de carbono. Este
proceso celular es semejante al estudiado en B. subtilis (Mukherjee, et al., 2011; Yakhnin et al.,
2007). Cabe mencionar que otro de los procesos regulado por estos genes es la biosíntesis flagelar,
teniendo en cuenta que el gen hag, es el responsable de codificar la producción de la proteína
flagelina (Babitzke & Romeo, 2007).
La secuencia de aminoácidos de la proteína CsrA se muestra en la figura 2, además se puede
observar la estructura aproximada de la proteína. De acuerdo con Müller, et al. (2019), CsrA es
una proteína la cual es altamente conservada y afecta la traducción o la estabilidad de transcritos
blancos, ha sido ampliamente estudiada en la subfamilia de las proteobacterias, pero muy poco
en el género Bacillus (Yakhnin, H. et al. 2007). Esta proteína ya ha sido estudiada en la bacteria
B. licheniformis M2-7, donde se pudo observar que está asociada a la degradación de gasolina, ya
que cuando la bacteria fue sometida a medio suplementado con este hidrocarburo, su expresión
relativa aumento dos veces más que en el control (Serrano-Ángel et al., 2020).
Diseño y construcción de los plásmidos pAmeA
Para el diseño del plásmido se utilizó el programa SnapGene, utilizando como referencia el
plásmido de clonación pJET1.2/Blunt (Fig. 3A), y la región codificante del gen csrA (Fig. 3B)
generando así, el plásmido pAmeA con un total de 3,199 pb (Fig. 3C). Aquí se puede observar
diferentes componentes de importancia para el análisis, como el sitio múltiple de clonación
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(SMC) donde se insertó el gen csrA, el gen de resistencia a ampicilina que se utilizó para
confirmar a las transformantes y diversos sitios de restricción que podrán ser utilizados durante
la confirmación de la construcción.
Construcción del plásmido pAmeA
La extracción permitió obtener ADN genómico de B. licheniformis M2-7, logrando una
concentración de 44 y 58 ng/uL y un rango de pureza de 1.8 (280/260 nm), lo que indica que no
hay presencia de contaminantes como proteínas o fenol, que se absorben a 280 nm (Thermo
Fisher, Nanodrop). Se confirmó también, que el gen csrA tiene un tamaño de 225 pb (Fig. 4A), se
purificó el fragmento obteniendo una concentración de 400 ng/ul y finalmente se ligó a
pJET1/2.Blunt.
Confirmación del plásmido pAmeA.
Se obtuvo un banco de 63 transformantes las cuales presentaron resistencia al antibiótico de
selección, confirmando así la inserción del plásmido de interés. Este hecho se confirmó a partir
de una PCR de colonia, donde se obtuvo un total de 16 cepas positivas para la amplificación del
gen csrA, cuya banda fue de 225 pb, esta metodología se utilizó con la intención de agilizar y
optimizar el proceso de confirmación del plásmido pAmeA (Yakhnin H., et al., 2011). Una vez
confirmada la presencia de los plásmidos en citoplasma de las cepas candidatas, se realizó la
extracción de ADN plasmídico (Fig. 4B), obteniendo una integridad y concentración adecuada,
confirmando una muestra libre de contaminantes. Kodackattumannil, P., et al; (2023), argumentan
que la extracción por kit comercial añade elementos como las RNAsas, que permiten la obtención
de muestras de alta calidad y pureza, por el contrario, los métodos caseros arrojan muestras de
ADN contaminadas con residuos que pueden alterar los procesos posteriores a la clonación.
Una de las premisas para la confirmación de la inserción de fragmentos en plásmidos de clonación
es la secuenciación de estos, por lo cual el gen csrA insertado en el plásmido pAmeA fue
secuenciado. Se obtuvo un porcentaje de similitud del gen csrA por arriba del 97% de homología
con el gen de la cepa de referencia B. licheniformis ATCC DSM 13 = ATCC 14580 (B14_00691
NCBI) permitiendo la confirmación de la correcta construcción del plásmido. Cabe mencionar
que el porcentaje de homología no cumplió el 100% debido a que durante el proceso de
pág. 8512
secuenciación normalmente ocurren errores por acción de la polimerasa o del secuenciador al
etiquetar incorrectamente nucleótidos de la secuencia (Bautista et al., 2015). Otro aspecto que
permite la secuenciación es determinar la orientación del gen insertado, debido a que se utilizan
el par de oligonucleótidos que permiten determinar por complementariedad de bases de la
orientación del gen estudiado. Además, esta metodología se caracteriza por permitir mostrar de
manera específica mutaciones en las diferentes bases nucleotídicas del gen estudiado, cuando es
alineada con los diferentes genomas de referencia del NCBI.
Perspectivas del proyecto
Con este trabajo se pretende realizar un plásmido de expresión del gen csrA y que en un futuro se
obtenga la cepa complementaria de LYA5, para que así la expresión heteróloga del gen permita
que la cepa recupere su fenotipo original y posteriormente cuantificar la expresión relativa del
gen csrA. Por otra parte, se espera evaluar el crecimiento de la cepa de B. licheniformis LYA5 en
otras fuentes de carbono para confirmar la interacción de CsrA con la degradación de los
hidrocarburos.
FIGURAS
Figura 1. Tamaño y distribución de los genes fliW, hag y csrA pertenecientes a B. licheniformis
DMS 13=ATCC 14580. Marcado en rojo se muestra el gen de interés csrA y en línea punteada se
muestra el inicio y final de la región codificante con un tamaño de 225 pb
pág. 8513
Figura 2. Modelo hipotético de la proteína CsrA y su secuencia de 74 aminoácidos. Se logran
diferenciar colores dentro de la gamma del azul que determinan su estructura proteica.
Figura 3. Diseño de plásmido pAmeA. A) Plásmido pJET1.2/Blunt linealizado; B) inserción de
csrA en el vector de clonación pJET1.2/Blunt; C) plásmido pAmeA que contiene el gene csrA.
C)
csrA
225 pb
B)
pJET1.2/Blunt
2974 pb
A)
pAmeA
3199 pb
pág. 8514
Figura 4. A) Amplificación del gene csrA. Gel de agarosa al 1% donde se utilizó una temperatura
de alineamiento de 51 °C. Carril MP: Marcador de peso molecular de 1Kb. Carril 1 y 2: Fragmento
de 225 pb correspondiente a csrA. B) Extracción de ADN plasmídico. Gel agarosa al 1%. Carril
1: plásmido pAmeA obtenido de la cepa candidata AmeA2; Carril 2: plásmido pAmeA obtenido
de la cepa candidata AmeA3; Carril 3: Marcador de peso molecular 1Kb.
CONCLUSIÓN
En este trabajo se lograron cumplir los objetivos postulados, se confirmó que el gen csrA
pertenece al operón de la síntesis flagear de Bacillus licheniformis. Se obtuvo la construcción y
confirmación del plásmido pAmeA conteniendo el gen csrA de Bacillus licheniformis M2-7,
también se obtuvo la construcción de la cepa de E. coli AmeA. Descartando mutaciones en el
plásmido por medio de la secuenciación.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a Eugenia Flores Alfaro, Gerardo Huerta Beristain, Sebastián Lorenzo Benito y
Erubiel Toledo Hernández por la asesoría y corrección del proyecto desarrollado.
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