DETERMINACIÓN DE POLIAMINAS EN
DEBARYOMYCES HANSENII INHIBIDA
QUÍMICAMENTE EN SU ACTIVIDAD
ORNITINA DESCARBOXILASA
POLYAMINES DETERMINATION IN DEBARYOMYCES
HANSENII WITH CHEMICALLY INHIBITED ORNITHINE
DECARBOXYLASE ACTIVITY
Dariel Tovar Ramírez
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, México
Laura Teresa Guzmán Villanueva
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, México
Andressa Teles
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, México
Norma Angélica Estrada Muñoz
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, México
pág. 12050
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v8i4.13389
Determinación de Poliaminas en Debaryomyces Hansenii Inhibida
Químicamente en su Actividad Ornitina Descarboxilasa
Dariel Tovar Ramírez
1
dtovar04@cibnor.mx
https://orcid.org/0000-0003-1204-9576
Centro de Investigaciones Biológicas del
Noroeste, S.C. (CIBNOR)
México
Laura Teresa Guzmán Villanueva
lguzman@cibnor.mx
https://orcid.org/0000-0002-9911-5291
Programa Investigadores por México (IxM)
CONAHCYT (Consejo Nacional de Ciencia,
Humanidades y Tecnología)
Centro de Investigaciones Biológicas del
Noroeste, S.C. (CIBNOR)
Unidad Guerrero Negro, Baja California Sur
México
Andressa Teles
andteles84@gmail.com
https://orcid.org/0000-0002-8453-6050
Centro de Investigaciones Biológicas del
Noroeste, S.C. (CIBNOR)
México
Norma Angélica Estrada Muñoz
nestrada@cibnor.mx
https://orcid.org/0000-0003-4254-9627
Programa Investigadores por México (IxM)
CONAHCYT (Consejo Nacional de Ciencia,
Humanidades y Tecnología) y Centro de
Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.
(CIBNOR), Baja California Sur
México
RESUMEN
El uso de inhibidores de ornitina descarboxilasa (ODC) es útil para estudiar a las poliaminas, pues es
una enzima clave en su biosíntesis. Las poliaminas en algunas especies han mostrado efectos positivos
sobre el desarrollo digestivo y crecimiento. Nuestro estudio evaluó las concentraciones de poliaminas
en la levadura Debaryomyces hansenii, utilizada como probiótico en acuicultura, comparando la
actividad normal de la ornitina descarboxilasa (ODC+) y la actividad inhibida químicamente (ODC-)
por DL-2-difluorometilornitina (DFMO). Las poliaminas cuantificadas mediante HPLC fueron
putrescina (put), espermina (spm) y espermidina (spd). Los resultados no mostraron cambios
significativos en las concentraciones de spm y spd entre grupos. Sin embargo, la concentración de put
en ODC- (2.04E-08 ± 3.45E-08 ng/mL) mostró un decremento significativo en relación a ODC+
(0.0010 ± 0.0017 ng/mL), lo cual puede deberse al uso de rutas alternas de biosíntesis que utiliza D.
hansenii para producir esta molécula. En conclusión, la inhibición de ODC por DFMO en D. hansenii
no afecta la producción de spm y spd, pero sí reduce significativamente la síntesis de put. Estos
hallazgos subrayan el potencial de las poliaminas, especialmente de la put, para incrementar el
crecimiento y mejorar el desarrollo del sistema digestivo en larvas y adultos de peces.
Palabras clave: debaryomyces hansenii, poliamidas, ornitina descarboxilasa, inhibidor DFMO
1
Autor principal
Correspondencia: lguzman@cibnor.mx
pág. 12051
Polyamines Determination in Debaryomyces Hansenii with Chemically
Inhibited Ornithine Decarboxylase Activity
ABSTRACT
The use of ornithine decarboxylase (ODC) inhibitors is helpful for studying polyamines, as it is a crucial
enzyme in their biosynthesis. Polyamines in some species have shown positive effects on digestive
development and growth. Our study evaluated concentrations of polyamines in the yeast Debaryomyces
hansenii, used as a probiotic in aquaculture, comparing the normal activity of ornithine decarboxylase
(ODC+) and the chemically inhibited activity (ODC-) by DL-2-difluoromethylornithine (DFMO).
Polyamines quantified by HPLC were putrescine (put), spermine (spm) and spermidine (spd). Results
showed no significant changes in spm and spd concentrations between the groups. However, the put
concentration in ODC- (2.04E-08 ± 3.45E-08 ng/mL) showed a significant decrease compared to ODC+
(0.0010 ± 0.0017 ng/mL), which may be due to the synthesis routes used by D. hansenii to produce this
molecule. In conclusion, inhibition of ODC by DFMO in D. hansenii does not affect spm and spd
production but significantly reduces put synthesis. These findings remark the potential of polyamines,
especially put, to increase growth and improve the development of the digestive system in fish larvae
and adults.
Keywords: debaryomyces hansenii, polyamines, ornithine decarboxylase, DFMO inhibitor
Artículo recibido 10 julio 2024
Aceptado para publicación: 15 agosto 2024
pág. 12052
INTRODUCCIÓN
El uso de probióticos ha experimentado un notable aumento en los últimos años con el fin de mejorar
tanto los rendimientos como la calidad de los cultivos larvarios de peces (Balcázar et al., 2006). Una
cepa destacada en este ámbito es Debaryomyces hansenii CBS 8339 (D. hansenii), reconocida como un
probiótico efectivo para animales acuáticos (Angulo et al., 2020). Diversos estudios han demostrado su
impacto en la maduración del tracto digestivo (Guzman-Villanueva, 2008; Teles et al., 2022), el
crecimiento (Tovar-Ramírez et al., 2004b) y sus propiedades inmunoestimulantes (Angulo et al., 2020;
Guzman-Villanueva, 2014a). Además, posee efectos prebióticos debido a los componentes de su pared
celular, principalmente glucanos y quitina, los cuales sirven como sustratos idóneos para la
fermentación por parte de bacterias productoras de ácidos grasos de cadena corta (Guzman-Villanueva
et al., 2014; Phillips, 2018).
Por otra parte, esta levadura secreta poliaminas como la putrescina (put), espermidina (spd), y espermina
(spm) (Tovar et al., 2004a), las cuales son cationes orgánicos (aminas alifáticas) fundamentales para el
crecimiento y la diferenciación celular; además, están involucradas en diversos procesos moleculares,
como la síntesis de ADN, ARN y proteínas (Phillips, 2018). La biosíntesis de poliaminas está regulada
por la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa (ODC) EC 4.1.1.17 (Rodríguez-Páez et al., 1991;
Campos-Gongora et al., 2018), sin embargo, existen pocos estudios sobre su uso en organismos de
importancia acuícola.
La comprensión del papel fisiológico de las poliaminas se ha facilitado por el desarrollo de inhibidores
potentes y específicos de la ODC, lo que ha abierto nuevas oportunidades de investigación como es su
efecto al ser administradas a través de la dietas. Entre estos inhibidores irreversibles, destaca el DFMO
(DL-2-difluorometilornitina), el cual ha sido empleado para explorar mecanismos relacionados con la
regulación de los niveles de poliaminas y las enzimas implicadas en su metabolismo (Pegg, 1986; Raul,
2007).
Dentro de los inhibidores irreversibles, DFMO es uno de los más efectivos para inhibir a la ODC, por
lo que su uso puede ayudar a conocer cuál es la ruta metabólica que es afectada en la síntesis de estas
poliaminas (Rodríguez-Páez et al., 1991), especialmente en D. hansenii donde la información es escasa.
pág. 12053
Aunque el papel de las poliaminas en la dieta de mamíferos ha sido objeto de estudios, la literatura
sobre sus efectos en larvas de peces es insuficiente. Tovar-Ramírez et al., (2002) sugirieron que la
secreción de spm y spd por D. hansenii mejoraban la maduración del tracto digestivo en larvas de
Dicentrarchus labrax. Por otro lado, Teles et al., (2022) indicaron que las poliaminas provenientes de
esta levadura podrían modular el desarrollo y la diferenciación larvaria al mejorar la expresión de
proteína morfogénica ósea y del antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), así como aumentar
la supervivencia de Seriola rivoliana pero no cuantifica las poliaminas presentes en D.hansenii.
Aunque existen diferentes reportes del uso de D. hansenii como probiótico en acuacultura, es difícil
evaluar individualmente los procesos biológicos que involucra la presencia de las poliaminas en larvas
de peces por lo que este trabajo propone la inhibición irreversible de la actividad ODC por DFMO para
conocer los cambios en la síntesis de poliaminas y en experimentos futuros poder determinar si estas
moléculas se pueden relacionar directamente al crecimiento y desarrollo larval.
METODOLOGÍA
Diseño experimental
Se evaluó la cinética de crecimiento y la síntesis de poliaminas en: (1) la levadura D. hansenii silvestre
con actividad ornitina descarboxilasa normal como grupo control (ODC+) y (2) D. hansenii con
actividad ornitina descarboxilasa químicamente inhibida por DFMO (ODC-). La inhibición química de
la levadura se llevó a cabo siguiendo la metodología de Pegg (1986), utilizando DFMO al 2%, el cual
actúa como un inhibidor químico e irreversible de la enzima ODC, encargada de la biosíntesis de
poliaminas.
Cultivo de la levadura Debaryomyces hansenii y cinética de crecimiento
Para realizar la cinética de crecimiento D. hansenii ODC+ y ODC-, las levaduras fueron cultivadas en
agar peptona dextrosa (YPD) con una composición de 2% de glucosa, 1% de peptona, 0.5% de extracto
de levadura y 2% de agar según Sherman (1991) a 30 ºC durante 24 h. Posteriormente fue recolectada
y suspendida en 25 mL, incubada 30 ºC durante 24 h y en agitación constante a 200 rpm.
El crecimiento de la levadura se monitoreó, midiendo el aumento de la densidad óptica (OD) a 550 nm
utilizando un espectrofotómetro Beckman DU® 640 durante un período de 24 h, hasta alcanzar la fase
estacionaria temprana. Se tomaron alícuotas de tres mL cada cuatro h, las cuales fueron utilizadas
pág. 12054
inmediatamente para cuantificar las poliaminas mediante cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) de fase reversa. Para cada tratamiento se llevaron a cabo seis réplicas.
Preparación de muestras para la extracción de poliamidas
Se recolectó el pellet de levadura ODC+ y ODC-, se lavó y se resuspendió en 0.8 mL de ácido perclórico
(HClO
4
) 0.2 M. Posteriormente, las muestras fueron sometidas a tres rondas de sonicación (10 s cada
una, con intervalos en baño de hielo) al 100% de potencia (aproximadamente 12 voltios/pin;
SonicMan™, Matrical, Inc., Spokane, WA, EE. UU.), las levaduras lisadas fueron centrifugadas a 3000
g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga BECKMAN GPR. Los sobrenadantes resultantes se
neutralizaron con una solución saturada de carbonato de sodio 3 M. Estas muestras fueron utilizadas
para cuantificar las poliaminas put, spd y spm por HPLC.
Cuantificación de poliamidas mediante HPLC
Reactivos y estándares
Los reactivos utilizados fueron cloruro de dansilo (cloruro de 5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonilo,
Fluka Biochemika, Suiza), ácido tricloroacético (99%, Fluka Biochemika, Suiza), acetonitrilo (ACN)
de calidad HPLC, ácido perclórico (J. T. Baker, EE. UU.), carbonato de calcio, ácido acético, carbonato
de sodio, agua de calidad HPLC y tolueno (99%, SIGMA, EE. UU.). Los estándares de aminas
biogénicas fueron diclorhidrato de putrescina, triclorhidrato de espermidina, tetraclorhidrato de
espermina y diclorhidrato de diaminopropano [diam; D2 (380-7)] como estándar interno, se disolvieron
por separado en agua de calidad HPLC, alcanzando una concentración final de base libre de 8 mg mL
1
.
Estos estándares fueron adquiridos en Sigma Aldrich, EE. UU., bajo las referencias P 7505, S 0381, S
2876 para las aminas biogénicas y P0380 para L-prolina (99%).
Determinación de poliamidas
Se cuantificaron las poliaminas put, spd y spm de D. hansenii (ODC+) y en presencia del inhibidor
DFMO (ODC-) en su fase exponencial mediante HPLC según el protocolo descrito por Mallé et al.
(1996), con modificaciones de acuerdo con Guzmán-Villanueva (2008). Para ello, se utilizó un sistema
de HPLC Waters modelo 2695 con detector de matriz de diodos (modelo 2996). La excitación de
fluorescencia se estableció a 333 nm y la emisión a 390 nm. Se emplearon columnas LC-18-DB (150
X 5 mm, diámetro de partícula 5 μm; Supelcosil™ SIGMA-ALDRICH).
pág. 12055
La separación de las poliaminas después de la derivatización del cloruro de dansilo se realizó mediante
elución en gradiente H
2
O/ACN (tiempo 0-22 min: H
2
O 40-0%, ACN 60-100%) a 25.0±2.0 °C y un flujo
de 1 mL min
-1
. Para la derivatización, se tomaron 100 µL del sobrenadante resultante de cada muestra
(preparado según el procedimiento de extracción de poliaminas), las células fueron resuspendidas en
20 µL de diaminopropano como estándar interno. A continuación, se añadieron 200 µL de CaCO
3
saturado y 400 µL de solución de cloruro de dansilo 0.027 M, se mezclaron e incubaron en baño de
agua a 60 °C durante 20 min. Posteriormente, se agregaron 100 μL de solución de L-prolina 0.08 M, se
agitó y se dejó reposar durante 20 min a temperatura ambiente en oscuridad. En seguida, se añadieron
500 μL de tolueno, se homogeneizó la mezcla y se dejó reposar durante 2 min a 25 °C. La fase orgánica
se recuperó y se evaporó bajo corriente de nitrógeno. El producto (gránulo) se resuspendió en 200 µL
de ACN, se filtró mediante una membrana Acrodisc (VWR) con un tamaño de poro de 0,.2 µm y se
inyectaron alícuotas de 30 µL de cada muestra en el sistema de HPLC.
Las poliaminas resultantes fueron cuantificadas mediante un detector de fluorescencia (modelo 420-
AC, Waters, Milford, MA) y la absorbancia de las poliaminas derivadas se midió a 254 nm.
Previamente, se prepararon curvas de los patrones utilizando put (99% de pureza), spd (98% de pureza)
y spm (95% de pureza) a concentraciones de 2.5, 5, 10 y 20 ng
-1
μL
-1
, utilizando diaminopropano como
estándar interno. Los resultados se expresan en mg Kg
-1
. Para cuantificar las poliaminas, se realizó un
análisis mediante la determinación del coeficiente de correlación (r) entre las áreas de los picos de cada
compuesto y las concentraciones estándar de amina. Se inyectaron seis réplicas de cada solución
estándar de amina y se aplicó una regresión lineal de mínimos cuadrados para calcular las pendientes,
intersecciones y coeficientes de correlación.
La concentración de amina biogénica en cada muestra (Cx) se determinó utilizando la siguiente fórmula:
(1) Cx = RFx×cIS×Ax = AIS.
Donde: RFx es el factor de respuesta de la amina, cIS es la concentración del estándar interno, Ax es el
área del pico de la amina biogénica y AIS es el área del pico del estándar interno.
El factor de respuesta de la amina RFx es calculado como:
(2) RFx=AIS/Ax×cx/cISRFx = AIS/Ax /times cx/cISRFx = AIS/Ax×cx/cIS.
pág. 12056
Se empleó diclorhidrato de 1,3-diaminopropano como estándar interno (IS) debido a los múltiples pasos
implicados en el procedimiento, y los datos se utilizaron para corregir las mediciones de recuperación
(R). La recuperación se calculó utilizando la fórmula:
(3) %R = [(CF – CU)/CA] X 100
Donde: CF es la concentración de la muestra enriquecida, CU es la concentración de la muestra original,
CA es la concentración del analito agregado.
Análisis estadístico
Se empleó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para evaluar la normalidad de los datos y la prueba de
Levene para verificar la homogeneidad. Con los datos de cada tratamiento (ODC+ y ODC-) se realizó
un análisis de varianza de una vía (ANOVA), P ≤ 0,05, utilizando el software estadístico SPSS 24.0
(IBM SPSS, Armonk, NY). Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Cuando
existieron diferencias significativas, se aplicaron pruebas de rangos múltiples de Tukey para comparar
las medias entre los tratamientos individuales.
RESULTADOS
Cinética de crecimiento y concentración de poliaminas
La cinética de crecimiento de Debaryomyces hansenii CBS 8339, tanto en ausencia como en presencia
del inhibidor químico DFMO, mostraron una curva sigmoidea típica, similar a lo reportado por Tovar
et al., (2002) y al comparar el crecimiento entre ODC+ y ODC- no se observaron diferencias
significativas. Lo cual no concuerda con Pfaller (1987), quien menciona que las poliaminas son
cruciales para el crecimiento y desarrollo celular. Además, el DFMO actúa como un potente inhibidor
del crecimiento de células altamente proliferativas, incluidos los microorganismos eucariotas
(Rodríguez-Páez et al., 1991).
En cuanto a la detección y cuantificación de poliaminas, nuestros resultados mostraron que la
concentración más alta de poliaminas fue durante la fase exponencial (20 h). Las poliaminas spd y spm
en ODC-, no presentaron diferencias significativas en relación con el grupo control ODC+ (Tabla 1).
Sin embargo, ODC- mostró un decremento significativo en la concentración de put en presencia del
inhibidor DFMO con respecto a ODC+ (Tabla 1).
pág. 12057
Aunque diferentes levaduras sintetizan y secretan diversas poliaminas (Buts et al., 1994), D. hansenii
fue seleccionada por su persistencia y capacidad de adherencia al tracto digestivo, así como por su
habilidad para secretar put, spd y spm ya que es usada como probiótico en acuacultura (Tovar et al.,
2004a). En contraste, estudios con S. boulardii indican que esta especie no secreta spm y spd (Buts et
al., 1994), mientras que S. cerevisiae puede sintetizar estas poliaminas (Tabor y Tabor, 1985) pero en
menor concentración (Tovar et al., 2004a)
Nuestros resultados mostraron que la presencia del inhibidor DFMO no afectó significativamente la
producción de spd y spm; sin embargo, si disminuyó la producción de put, esto concuerda con Luk et
al., (1980), quienes reportaron que DFMO inhibe en un 65% la actividad de ODC, reduciendo así la
síntesis de poliaminas. De otra mano, Kallio y McCann (1981) no observaron tal disminución durante
la fase exponencial en E. coli, lo que podría deberse al aumento en la actividad descarboxilasa de
arginina, otra vía de síntesis de poliaminas, pero desconocida en D. hansenii.
En relación a DFMO, la primera fase de la reacción es activada por la ODC y posteriormente esta
sustancia se une covalentemente con un grupo nucleofílico de la enzima, produciendo una inhibición
irreversible (Sjoerdsma,1981). Lo importante de este mecanismo es que introduce dos parámetros de
especificidad: el compuesto no sólo debe entrar al sitio activo de la enzima, sino que por lo menos debe
realizarse parte del mecanismo catalítico normal antes de que se transforme en un inhibidor irreversible
(Rodríguez-Páez et al., 1991). Otro punto que hay que tomar en cuenta son las diferencias en las enzimas
debidas a la especie, como, por ejemplo, DFMO inhibe a la ODC de Pseudomonas aeruginosa y no
inhibe a Klebsiella pneumoniae (Kallio y McCann, 1981).
La put es una poliamina fundamental que desempeña un papel crucial en múltiples procesos biológicos,
está implicada en respuestas al estrés, crecimiento y desarrollo en organismos como plantas, animales
y hongos (Wu et al., 2017). Igarashi y Kashiwagi (1999) mencionan que la disminución de put puede
ser benéfica ya que su acumulación podría afectar el crecimiento celular.
La descarboxilación de la ornitina no es la única ruta para la síntesis de put, algunos autores han
reportado que la ruta de la arginina descarboxilasa podría estar involucrada también en la biosíntesis de
put, así como ciertos procesos de retroconversión de spd a put (Valdés-Santiago y Ruiz-Herrera, 2014),
estas rutas alternas para biosíntesis de poliaminas podrían explicar las diferencias significativas que se
pág. 12058
presentaron en put pero no en spd y spm entre ODC- y ODC+.
Por otra parte, la inhibición de put en Ustilago maydis mostró no ser esencial para el crecimiento y
menciona que su principal función radica en ser un intermediario en la biosíntesis de la spd (Valdés-
Santiago L. et al., 2010).
Los resultados obtenidos en este trabajo son de gran interés ya que exploran una estrategia para modular
los niveles de poliaminas en probióticos como es D. hansenii y su efecto sobre el crecimiento celular.
Por otra parte, en un futuro es importante realizar más investigaciones sobre la producción de
poliaminas y la administración en la dieta de D. hansenii durante etapas larvarias y la deshabituación
alimenticia para ayudar a conocer los procesos implicados en el desarrollo y maduración digestiva en
peces de importancia acuícola.
ILUSTRACIONES, TABLAS, FIGURAS.
Tabla 1. Concentración de poliaminas determinadas por HPLC.
Valores expresados en media ± desviación estándar. ODC+ = Debaryomyces hansenii, ODC- = Debaryomyces hansenii
inhibida en su actividad ODC con DMFO. * = diferencias significativas (p≤0.05), n = 6.
CONCLUSIONES
En nuestro estudio se encontró que DL-2-difluorometilornitina es un potente e irreversible inhibidor de
la enzima ornitina descarboxilasa en D. hansenii y consecutivamente disminuye la biosíntesis de
putrescina. Sin embargo, DFMO adicionado al medio de cultivo de la levadura, no afecta su
crecimiento. Por lo anteriormente mencionado se concluye lo siguiente:
1. La cinética de crecimiento de la levadura Debaryomyces hansennii no es afectada por el inhibidor
DFMO.
pág. 12059
2. La inhibición de la enzima ODC por DFMO en la levadura D. hansenii, no afecta la producción de
las poliaminas espermina y espermidina.
3. El inhibidor DFMO disminuye significativamente la síntesis de la poliamina putrescina en
Debaryomyces hansenii.
Esta información es de gran interés ya que el uso de las poliaminas puede tener importantes usos en el
crecimiento y salud animal. Nuestros resultados demuestran que la modulación de la producción de
poliaminas puede tener aplicaciones en estudios futuros, como son el desarrollo de medidas profilácticas
en cultivos acuícolas y estrategias para la creación de alimentos funcionales adicionados con probióticos
como es D. hansenii, principalmente durante etapas larvarias donde pueden ocurrir altas mortalidades.
Además, este trabajo puede ser usado como un antecedente para conocer el efecto de estas moléculas
sobre el crecimiento celular, supervivencia y maduración digestiva, los cuales son procesos
considerados cuellos de botella en la producción de larvas de peces, aunque aún se deberán realizar
investigaciones sobre la producción de poliaminas y la administración en la dieta de D. hansenii durante
la ontogenia y la deshabituación alimenticia, este tipo de investigaciones puede ayudar a generar
conocimientos sobre los procesos implicados en el desarrollo y maduración digestiva en peces de
importancia acuícola.
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