IDENTIFICACIÓN METAGENÓMICA DE
MICROORGANISMOS DEL LÍQUIDO
RUMINAL Y HUMUS DE LOMBRIZ,
BIODEGRADADORES DE PLÁSTICOS
METAGENOMIC IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS
FROM RUMINAL FLUID AND WORM HUMUS, PLASTIC
BIODEGRADERS
Mario Miguel Samamé Saavedra
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo
Julio César Arellano Barragán
Universidad Nacional de Trujillo
Ana Lucía Tocto Tomapasca
Universidad Nacional de Trujillo
Luis Enrique Manrique Salvador
Universidad Nacional del Santa
pág. 1025
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i1.15859
Identificación metagenómica de microorganismos del líquido ruminal y
humus de lombriz, biodegradadores de plásticos
Mario Miguel Samamé Saavedra1
mario.samame87@gmail.com
https://orcid.org/0009-0005-5727-5675
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo
Perú
Julio César Arellano Barragán
jcab442@hotmail.com
https://orcid.org/0000-0003-1516-2531
Universidad Nacional de Trujillo
Perú
Ana Lucía Tocto Tomapasca
ana.tocto.02@gmail.com
https://orcid.org/0009-0006-7488-5827
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo
Perú
Luis Enrique Manrique Salvador
lemsmanrique@gmail.com
https://orcid.org/0000-0001-6463-094X
Universidad Nacional del Santa
Perú
RESUMEN
La biodegradación es un método ampliamente empleada en la biorremediación de polímeros que permite
controlar la alteración de ecosistemas perjudicados por las actividades antropogénicas. El objetivo fue
determinar la capacidad de biodegradación del consorcio microbiano del líquido ruminal vacuno y humus
de lombriz, sobre el polietileno de baja densidad y tereftalato a diferentes condiciones de temperatura y
humedad, e identificar los microorganismos involucrados en este proceso. La metodología fue experimental
en la cual se emplearon 120 láminas de PET y 120 de PEBD de 2,5 cm x 2,5 cm, sumergidas dentro de
frascos estériles con líquido ruminal y humus, las láminas y sus repeticiones fueron extraídas de los frascos
mensualmente durante 7 meses. La identificación de los microorganismos fue desarrollada mediante un
análisis metagenómico, lo que permitió la identificación de microorganismos en el líquido ruminal como
en el humus de lombriz, encontrando los géneros más comunes Bacillus, Methanosarcina y Advenella,
además el valor de biodegradación más alto fue de 4,5 % para el tratamiento de humus de lombriz con
polietileno de baja densidad a temperatura de incubación entre 25° a 27 °C.
Palabras clave: advenella, bacillus, methanosarcina, pcr, secuenciación
1
Autor principal
Correspondencia: mario.samame87@gmail.com
pág. 1026
Metagenomic identification of microorganisms from ruminal fluid and worm
humus, plastic biodegraders
ABSTRACT
Biodegradation is a method widely used in the bioremediation of polymers that allows controlling the
alteration of ecosystems damaged by anthropogenic activities. The objective was to determine the
biodegradation capacity of the microbial consortium of bovine ruminal fluid and worm humus on low-
density polyethylene and terephthalate at different temperature and humidity conditions, and to identify the
microorganisms involved in this process. The methodology was experimental in which 120 sheets of PET
and 120 of PEBD measuring 2.5 cm x 2.5 cm were used, submerged in sterile jars with ruminal fluid and
humus. The sheets and their repetitions were removed from the jars monthly. for 7 months. The
identification of the microorganisms was developed through a metagenomic analysis, which allowed the
identification of microorganisms in the ruminal fluid and in the worm humus, finding the most common
genera Bacillus, Methanosarcina and Advenella, in addition the highest biodegradation value was 4.5% for
the treatment of worm castings with low-density polyethylene at an incubation temperature between 25° to
27°C.
Keywords: advenella, bacillus, sequencing, methanosarcina, pcr
Artículo recibido 19 diciembre 2024
Aceptado para publicación: 24 enero 2025
pág. 1027
INTRODUCCIÓN
Los plásticos, protagonistas principales en todos los hogares por su uso cotidiano y desmedido, forma,
propiedades y utilidad, se caracterizan principalmente por el tiempo que tardan en biodegradarse
alcanzando en algunos casos hasta 600 años aproximadamente, entre ellos tenemos al polietileno de baja
densidad (PEBD) y el tereftalato de polietileno (PET), estos derivados del petróleo son considerados
grandes contaminantes, porque se dispersan por acción del viento perjudicando a las especies que habitan
en los ecosistemas. (Awasthi et al., 2020; Geyer et al., 2017; Lee et al., 1991) señalaron en su estudio sobre
la fabricación, empleo y comercialización de plásticos que los residuos de estos materiales se incrementó
al 47% del total de restos generados a nivel mundial, la mitad de estos polímeros sintéticos procedentes
principalmente de Asia y que constituyen un escenario preocupante debido a que la mayoría de estos
residuos no son reciclados y se encontran libres en el ambiente, por otro lado, la incineración de los
polímeros libera gases tóxicos producto del tratamiento térmico que puede ocasionar problemas de salud
pública como algunos tipos de cáncer.
Para fines de ese año es China, el mayor productor a nivel mundial de residuos plásticos seguidos por Japón
y la Unión Europea, en ese contexto luego de su uso, según su destino final podrían ser reciclados,
quemados, enterrados, soterrados en basurales, desechados en lugares poco usuales o simplemente
eliminados al ambiente, se estima que el 79% representa el porcentaje de polímeros plásticos producidos
hasta la fecha encontrados en basurales o en el ambiente, de los cuales solo el 12 % fueron incinerados y
sólo el 9% han fueron reciclados (UNEP, 2018).
La estructura de algunos polímeros plásticos como la del polietileno de baja densidad cuando entran en
contacto con materia orgánica descompuesta de los botaderos es transformada naturalmente por
microorganismos mediante el proceso de biodegradación a través de enzimas presentes en bacterias y
hongos principalmente (Shalini & Sasikumar, 2015; Uribe et al., 2010) de esta manera la biodegradación
microbiana se presenta como una posible solución ambiental ante el uso desmedido de residuos plásticos,
entre estos microorganismos se encuentran las Pseudomonas spp. que cuentan por acción de enzimas, a
condiciones óptimas de temperatura y según la naturaleza del polímero, la capacidad para degradarlos,
reduciéndolos bioquímicamente y modificando su estructura hasta alcanzar moléculas simples como
metano, anhidrido carbónico y agua, lo que permite su asimilación como fuente de carbono y reducir
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significativamente el tiempo de biodegradación (Ccallo Arela et al., 2020; Li et al., 2020).
En ese sentido, frente a la urgente necesidad de disminuir los residuos plásticos como el tereftalato de
polietileno y el polietileno de baja densidad por su uso habitual, surgieron algunas alternativas con
consecuencias perjudiciales al ambiente, como la incineración de estos materiales que liberaron gran
cantidad de gases y sustancias tóxicas a la atmósfera provocando como impacto negativo el efecto
invernadero, produciendo el recalentamiento de la capa de ozono y crisis climática como la que está
aconteciendo en todo el planeta (Segura et al., 2015).
Actualmente, se han desarrollados estudios experimentales orientados a evidenciar la degradación del
polietileno de baja densidad por acción de Staphylococcus sp así como, explicar el proceso de aislamiento
y biodegradación de la cepa bacteriana sobre el polímero plástico (Arotoma Oré et al., 2021), otros estudios
han demostrado a través de aislamientos e identificación microbiológica la capacidad de microorganismos
específicos para biodegradar polímeros plásticos en condiciones controladas de temperatura como
alternativa de solución ambiental frente al uso desmedido, la generación excesiva de residuos y micro
plásticos en el mar (Archana et al., 2017). Otras investigaciones relacionadas lograron determinar la
capacidad de biodegradación de polímeros elaborados a base de almidón de tapioca, policaprolactona y
ácido poliláctico con microorganismos anóxicos obtenidos del estómago de los rumiantes al entrar en
contacto con trozos de rumen vacuno, liquido ruminal provenientes del camal municipal de la ciudad y
restos de comida en descomposición (Camacho-Muñoz & Luis Hoyos-Concha, 2014), por otro lado, se
logró identificar la presencia de los géneros bacterianos Bacillus spp y Clostridium spp en el humus de
lombriz, los cuales presentaron una potencial capacidad para alcanzar la biodegradación del polímero
expandido o tecnopor ubicadas en recipientes con humus de lombriz a distintas profundidades y tiempos
(Chunga Campos & Cieza Martínez, 2017).
Sin embargo, a la fecha aún es limitado los estudios metagenómicos comparativos que hayan aplicado
distintos tratamientos como el líquido ruminal vacuno y humus de lombriz de forma simultánea para
biodegradar polímeros plásticos como el tereftalato de polietileno y el polietileno de baja densidad.
Ante lo expuesto, el objetivo de este estudio fue determinar la capacidad de biodegradación del consorcio
microbiano aislados del líquido ruminal vacuno y humus de lombriz, basándose en un análisis gravimétrico
que permitió determinar la diferencia de masas de las láminas de tereftalato de polietileno y polietileno de
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baja densidad sometidos con ambos tratamientos, así mismo analizar los consorcios microbianos a través
de técnicas moleculares y determinar los microorganismos que intervinieron en el proceso de
biodegradación
METODOLOGÍA
Incubación de láminas de PET y PEBD en sustrato de líquido ruminal y humus de lombriz
Se incubó los materiales plásticos de 2,5 cm por 2,5 cm de superficie, en frascos de vidrio previamente
esterilizados, se adicionó 250 ml de líquido ruminal como tratamiento biodegradativo de los polímeros,
obteniendo en total 4 frascos con líquido ruminal, tanto para las muestras de PET y PEBD a temperatura
ambiente e incubación. De la misma forma se incorporó en 4 frascos esterilizados 400 g/frasco de humus
de lombriz como sustrato, tanto las muestras de PET y PEBD fueron incubadas por 6 meses a temperatura
ambiente (25 a 27°C), finalmente se sumergieron 30 láminas por cada frasco para determinar hasta el
término del ensayo, la variación de sus pesos. Las láminas de los 8 frascos de vidrio, 4 del líquido ruminal
y 4 humus de lombriz, fueron extraídos mensualmente con la finalidad de determinar y comprara sus pesos
iniciales y finales (Acuña Molina, 2017).
Determinación de masas residuales de láminas de PET y PEBD
El análisis consistió en medir las masas residuales de las láminas de PEBD y PET por el método
gravimétrico con una balanza analítica marca Sartorius serie ED224S (con sensibilidad 0.1 mg),
mensualmente las láminas fueron retiradas de los frascos con los tratamientos ,se lavaron y se colocaron
sobre una tela esterilizada y se dejaron secar toda la noche a temperatura ambiente, al día siguiente las
láminas se llevaron al laboratorio de la Universidad Nacional de Cajamarca filial Celendín y fueron pesadas
en la balanza analítica determinando la masa perdida de cada lámina, el resultado se expresó en unidades
(gramos) y mediante *fórmula se estimó el porcentaje de biodegradación.
Este análisis determinó la diferenciación directa de las masas del PEBD y PET que fueron sometidos a
condiciones de degradación biológica. El fundamento básico de la pérdida de masa es la biodegradación
del PEBD y del PET, los cuales se eligieron por su composición para ser degradados como nutrientes y
composición rica en carbonos. con una balanza analítica los polímeros antes y después de realizar un ensayo
de cultivo (Acuña Molina, 2017) (Das & Kumar, 2015).
* %Biodegradación= [(masa inicial - masa final) / masa inicial]x100
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masa inicial = masa inicial del plástico (g)
masa final= masa final (g) del plástico en función del tiempo (mensualmente) o después de: (30, 60, 90,
120, 150, 180, 210) días.
Preparación de las muestras para extracción de ADN
La preparación de las muestras para la extracción del ADN se realizó según Conde et al., (2006) con la
excepción de la muestra que fue obtenida del material biológico adherido a las láminas plásticas del cual
se obtuvo 250 miligramos de cada muestra.
Extracción de ADN metagenómico de muestras de líquido ruminal y humus de lombriz
La extracción del ADN metagenómico a partir de las muestras procedentes del líquido ruminal fueron
obtenidas empleando el kit Zymo BIOMICS DNA Miniprep, mientras que la extracción del ADN a partir
del humus de lombriz fue realizada empleando el kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep (ZymoResearch) y
el kit DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen) debido a la presencia elevada de inhibidores, estos procesos fueron
desarrollados considerando las recomendaciones del fabricante del kit y las recomendaciones reportadas
por (López & Mejía, 2012) y Wright et al., (2017).
Cuantificación y evaluación de la pureza e integridad del ADN
La cuantificación de ADN obtenido de las muestras de líquido ruminal extraída con el kit Zymo BIOMICS
DNA Miniprep (ZymoResearch) y de la muestra de ADN de humus de lombriz extraída con el kit DNeasy
PowerSoil Pro (Qiagen), fue realizada mediante el espectrofotómetro Nanodrop 2000, se evaluó la relación
A260/A280 para determinar la pureza.
Para verificar la integridad del ADN se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 2%, para el cual se
colocó las muestras de ADN en cámara de electroforesis a 80 voltios por 80 minutos. Cabe mencionar que
una muestra de ADN es considerada íntegra cuando sobre el carril de la muestra se visualiza una banda
conservada. El grado de separación o división de una muestra está definido por la pérdida de la conservación
de la banda superior y el acoplamiento de un haz o a lo largo del carril de la muestra (López & Mejía, 2012).
Amplificación de las regiones de interés mediante electroforesis capilar (Agilent 5400)
La amplificación del gen ARNr 16SV3-V4 y ITS2 se realizó empleando la reacción en cadena de la
polimerasa, las moléculas usadas como iniciadoras de ARNr 16SV3-V4 (341F:
CCTAYGGGRBGCASCAG y 806R: GGACTACNNGGGTATCTAAT) y de ITS2 (2024F:
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GCATCGATGAAGAACGCAGC y 2409R: TCCTCCGCTTATTGATATGC) se acondicionaron las 2
muestras de ADN genómico de los tratamientos añadiendo por separado el buffer para electroforesis. La
mezcla total contenía 5 μL de primers de forward, 5 μL de primers de reverse, 5 μL de ADN genómico,15
μL de solución para PCR, la mezcla final no debió exceder los 30 μL, para impedir el trasvase por la rendija
de la cubeta de la muestra. El corrido electroforético se realizó a 150 voltios invariables, a estas condiciones
la electroforesis se llevó a cabo en 1 hora aproximadamente, durante este tiempo se desnaturalizó a 94 °C
durante 1 minuto, se ejecutaron 30 ciclos de temperatura, siguiendo el ciclo: desnaturalización a 94 °C por
50 segundos, el acoplamiento de los oligonucleótidos a 55 °C durante 30 segundos y la elongación de la
cadena complementaria a 72 °C durante 60 segundos. El resultado de la PCR se verificó a través de
electroforesis en agarosa al 1 % por fluorometría (Qubit) (Riversa Salazar et al., 2023), posteriormente se
hizo un control de calidad mediante el método electroforesis capilar para (16S) o electroforesis en gel de
agarosa (ITS) para confirmar la presencia del amplicón de tamaño deseado. El control de calidad para
verificar la amplificación de la región 16S a secuenciar se realizó mediante electroforesis capilar
automatizada, mientras que la verificación de la amplificación de la región ITS se realizó mediante
electroforesis en gel de agarosa. Dado que la muestra de ADN líquido ruminal no pasó el control de calidad
(posiblemente por impurezas presentes en la muestra de ADN), se optó por realizar una purificación del
ADN mediante perlas magnéticas antes de intentar amplificar nuevamente las regiones de interés, con
resultados satisfactorios.
Preparación de librerías y secuenciamiento
Las librerías 16SV3-V4 e ITS2 fueron preparadas y secuenciadas por la empresa Novogen Co. Tras la
primera PCR, se realizó un control de calidad mediante electroforesis capilar (16S) o electroforesis en gel
de agarosa (ITS) para verificar la presencia del amplicón de tamaño esperado. Una vez verificado esto, se
continuó con el protocolo estándar de preparación de librerías pareadas y secuenciamiento por NGS
empelando el equipo Illumina.
Análisis Bioinformático
Se evaluó el número de lecturas por muestra y la calidad de los datos de secuenciamiento de rRNA 16S e
ITS fue desarrrollada mediante el software FastQC versión 0.12.1. Luego, las lecturas de cada muestra
fueron importadas en la plataforma QIIME2 (versión 2023.5.0), se eliminaron los iniciadores de rRNA
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16SV34 (341F: CCTAYGGGRBGCASCAG y 806R: GGACTACNNGGGTATCTAAT) y de ITS2
(2024F: GCATCGATGAAGAACGCAGC y 2409R: TCCTCCGCTTATTGATATGC) presentes en las
lecturas de sus respectivas bibliotecas utilizando el complemento cutadapt.
En este procedimiento, se mantuvieron las lecturas que tuvieron un tamaño mínimo de 100 nucleótidos, y
ambos R1 y R2 presentes después del filtro, y se descartaron las lecturas que no fueron cortadas por no
poseer ninguno de los iniciadores. Luego, utilizando el complemento DADA2, las lecturas fueron
recortadas en los extremos donde tienen la calidad más baja, se eliminó el ruido de las lecturas en base a su
secuencia, los R1 y R2 correspondientes, luego los fragmentos fueron ensamblados manteniendo una
superposición de 20 nucleótidos, se eliminaron los fragmentos quimeras, para finalmente obtener las
variantes de secuencias amplicón (ASV).
A continuación, utilizando las secuencias ASV se realizó la clasificación taxonómica al nivel de especie o
cepa utilizando como referencia la base de datos de SILVA (versión 138_99_16S) y UNITE (versión 9.0).
Con base en los resultados de clasificación obtenidos, los ASV clasificados como ADN de cloroplasto y
mitocondria fueron eliminados, así como aquellos que no se clasificaron al menos hasta el nivel de filo.
Finalmente, los valores de alfa y beta diversidad fueron calculados con el complemento diversity de
QIIME2, considerando el número más bajo de ASV de las muestras como valor de referencia en la
profundidad de muestreo.
RESULTADOS
Figura 1
Porcentaje de biodegradación de los polímeros con los tratamientos líquido ruminal y humus de lombriz
0,00%
0,50%
1,00%
1,50%
2,00%
2,50%
3,00%
3,50%
4,00%
4,50%
5,00%
30 60 90 120 150 180 210
Porcentaje de biodegradación de los polímeros por el líquido
ruminal y el humus de lombriz
LR+PET(TA) LR+PEBD(TA) LR+PET(TI) LR+PEBD(TI) HL+PET(TA) HL+PEBD(TA) HL+PET(TI) HL+PEBD(TI)
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Cuantificación de ADN metagenómico
La muestra de ADN obtenido del líquido ruminal extraído empleando el kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep
(ZymoResearch) presentó una concentración en nanodrop de 66,4 ng/µL y de 64 obtenido en Qubit, en
relación a la calidad del ADN estos presentaron valores en la proporción 260/280 de 1,93 y en 230/260 de
1,44; la muestra de ADN mostró valores adecuados para el proceso de secuenciamiento por NGS.
Por otro lado, la extracción de ADN a partir de humus de lombriz realizado empleando el kit
ZymoBIOMICS DNA Miniprep (ZymoResearch) presentó una concentración en nanodrop de 25,7 ng/µL
y 5,6 empleando Qubit, en relación a la calidad del ADN estos presentaron valores en la proporción 260/280
de 1,79 y en 230/260 de 0,1; la muestra de ADN no presentó valores adecuados para el proceso de
secuenciamiento por NGS. Mientras que, empleando el kit DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen) presentó una
concentración en nanodrop de 367,6 ng/µL y 243 empleando Qubit, en relación a la calidad del ADN estos
presentaron valores en la proporción 260/280 de 1,9 y en 230/260 de 2.05; la muestra de ADN se mostró
valores adecuados para el proceso de secuenciamiento por NGS, como se detalla en la tabla 1.
El análisis cuantitativo de ADN de las muestras por nanoespectrofotometría, mostró una diferencia
significativa entre el uso de un kit y otro para la extracción de ADN de las muestras, esto debido a la
presencia de concentraciones elevadas de inhibidores como ácido húmico en el humus de lombriz lo cual
generó error en las lecturas.
Tabla 1
Concentración y pureza de las muestras de ADN extraídas.
Nanodrop 2000/2000c
MUESTRA
Concentración
(ng/μL)
A260/280
260/230
LR (kit Zymo)
66,4
1,93
1,44
HL (kit Zymo)
25,7
1,74
0,1
HL (kitQiagen)
367,6
1,90
2,05
A:Absorbancia, HL:Humus de Lombriz LR: Líquido Ruminal
Integridad del ADN extraído mediante electroforesis en gel de agarosa
Las muestras de ADN obtenido a partir del líquido ruminal extraída con el kit Zymo BIOMICS DNA
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Miniprep (ZymoResearch) y de las muestras de ADN de humus de lombriz extraída además con el kit
DNeasy PowerSoil Pro(Qiagen), fueron procesadas en gel de agarosa al 2% y visualizadas en el
transiluminador.
Se logró visualizar un ADN genómico integro en ambas muestras (Fig. 2 y 3)
Figura 2
Electroforesis en gel de agarosa de las muestras de ADN extraídas con el Kit Zymo BIOMICS DNA
Miniprep. M: Marcador de peso molecular de DNA 1Kb; 1: ADN de Líquido Ruminal; 2: ADN de Humus
de lombriz.
Figura 3
Electroforesis en gel de agarosa de la muestra de ADN extraída con el Kit DNeasy PowerSoil Pro. M:
Marcador de peso molecular de DNA 1Kb; 1: ADN de Humus de lombriz.
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Amplificación de las regiones de interés mediante electroforesis capilar (Agilent 5400) y electroforesis
en gel de agarosa
Dado que la muestra de ADN procedente del líquido ruminal no pasó este control de calidad (posiblemente
por impurezas presentes en la muestra de ADN), se optó por realizar una purificación del ADN (mediante
perlas magnéticos) antes de intentar amplificar nuevamente las regiones de interés, con resultados
satisfactorios (figura 4 y 5).
Figura 4
El control de calidad para verificar la amplificación de la región 16S rRNA a secuenciar se realizó mediante
electroforesis capilar automatizada, mientras que la verificación de la amplificación de la región ITS se
realizó mediante electroforesis en gel de agarosa
HL-16S