CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y
MOLECULAR DE FITOPATÓGENOS CAUSANTES
DE PUDRICIÓN DEL TALLO EN NICOTIANA
TABACUM L.
MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR
CHARACTERIZATION OF PHYTOPATHOGENS CAUSING
STEM ROT IN NICOTIANA TABACUM L.
Johana Carolina Guanoquiza Calero
Universidad Técnica Estatal de Quevedo – Ecuador
Emilio Ramiro Freire Vaca
Universidad Técnica Estatal de Quevedo – Ecuador
Joselyn Jacqueline Quintana Zambrano
Universidad Técnica Estatal de Quevedo - Ecuador
pág. 1244
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i3.17723
Caracterización morfológica y molecular de fitopatógenos causantes de
pudrición del tallo en Nicotiana tabacum L.
Johana Carolina Guanoquiza Calero1
carolina.guanoquiza2015@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0009-0003-1072-0642
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
Quevedo, Ecuador
Emilio Ramiro Freire Vaca
emilio.freire2015@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0009-0002-1741-048X
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
Quevedo, Ecuador
Joselyn Jacqueline Quintana Zambrano
joselyn.quintana2014@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0009-0008-8893-5949
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
Quevedo, Ecuador
RESUMEN
La pudrición del tallo en Nicotiana tabacum L. representa un problema fitosanitario que afecta el
desarrollo y rendimiento del cultivo. El objetivo de este estudio fue aislar e identificar los fitopatógenos
asociados a esta enfermedad mediante métodos morfológicos y moleculares. Se recolectaron muestras
de tallos con síntomas en la Tabacalera San Carlos. El aislamiento se realizó en medios de cultivo PDA
(hongos) y agar nutritivo (bacterias) seguido de una purificación. La caracterización morfológica
permitió observar estructuras reproductivas como microconidios, macroconidios y clamidosporas en el
caso del hongo, así como determinar la reacción de Gram y la morfologia celular en las bacterias. Para
la identificación molecular, se amplificó y secuenció la región ITS para hongos y el gen 16S rRNA para
bacterias. Los resultados reflejaron la presencia de Fusarium oxysporum con un 99.85 % de similitud y
100 % de identidad (accesión MN417196.1) y Enterobacter hormaechei con un 99.80 % de similitud y
100 % de identidad (accesión CP017186.1). La identificación precisa de estos patógenos permitirá
desarrollar estrategias de manejo fitosanitario más eficaces y responsables con el ambiente.
Palabras claves: aislamiento, patógenos, marchitamiento, Solanáceas
1 Autor principal
Correspondencia: carolina.guanoquiza2015@uteq.edu.ec
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i3.17723
Caracterización morfológica y molecular de fitopatógenos causantes de
pudrición del tallo en Nicotiana tabacum L.
Johana Carolina Guanoquiza Calero1
carolina.guanoquiza2015@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0009-0003-1072-0642
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
Quevedo, Ecuador
Emilio Ramiro Freire Vaca
emilio.freire2015@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0009-0002-1741-048X
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
Quevedo, Ecuador
Joselyn Jacqueline Quintana Zambrano
joselyn.quintana2014@uteq.edu.ec
https://orcid.org/0009-0008-8893-5949
Universidad Técnica Estatal de Quevedo
Quevedo, Ecuador
RESUMEN
La pudrición del tallo en Nicotiana tabacum L. representa un problema fitosanitario que afecta el
desarrollo y rendimiento del cultivo. El objetivo de este estudio fue aislar e identificar los fitopatógenos
asociados a esta enfermedad mediante métodos morfológicos y moleculares. Se recolectaron muestras
de tallos con síntomas en la Tabacalera San Carlos. El aislamiento se realizó en medios de cultivo PDA
(hongos) y agar nutritivo (bacterias) seguido de una purificación. La caracterización morfológica
permitió observar estructuras reproductivas como microconidios, macroconidios y clamidosporas en el
caso del hongo, así como determinar la reacción de Gram y la morfologia celular en las bacterias. Para
la identificación molecular, se amplificó y secuenció la región ITS para hongos y el gen 16S rRNA para
bacterias. Los resultados reflejaron la presencia de Fusarium oxysporum con un 99.85 % de similitud y
100 % de identidad (accesión MN417196.1) y Enterobacter hormaechei con un 99.80 % de similitud y
100 % de identidad (accesión CP017186.1). La identificación precisa de estos patógenos permitirá
desarrollar estrategias de manejo fitosanitario más eficaces y responsables con el ambiente.
Palabras claves: aislamiento, patógenos, marchitamiento, Solanáceas
1 Autor principal
Correspondencia: carolina.guanoquiza2015@uteq.edu.ec
pág. 1245
Morphological and molecular characterization of phytopathogens causing
stem rot in Nicotiana tabacum L.
ABSTRACT
Stem rot in Nicotiana tabacum L. represents a phytosanitary problem that affects the development and
yield of the crop. The objective of this study was to isolate and identify the phytopathogens associated
with this disease using morphological and molecular methods. Symptomatic stem samples were
collected from the San Carlos Tobacco Company. Isolation was carried out using PDA medium (for
fungi) and nutrient agar (for bacteria), followed by purification. Morphological characterization allowed
observation of reproductive structures such as microconidia, macroconidia, and chlamydospores in the
case of the fungus, as well as determination of Gram reaction and cell morphology in the bacteria. For
molecular identification, the ITS region was amplified and sequenced for fungi, and the 16S rRNA gene
for bacteria. The results revealed the presence of Fusarium oxysporum with 99.85% similarity and 100%
identity (accession MN417196.1), and Enterobacter hormaechei with 99.80% similarity and 100%
identity (accession CP017186.1). The accurate identification of these pathogens will allow the
development of more effective and environmentally responsible phytosanitary management strategies.
Keywords: isolation, pathogens, wilting, Solanaceae
Artículo recibido 15 marzo 2025
Aceptado para publicación: 15 abril 2025
Morphological and molecular characterization of phytopathogens causing
stem rot in Nicotiana tabacum L.
ABSTRACT
Stem rot in Nicotiana tabacum L. represents a phytosanitary problem that affects the development and
yield of the crop. The objective of this study was to isolate and identify the phytopathogens associated
with this disease using morphological and molecular methods. Symptomatic stem samples were
collected from the San Carlos Tobacco Company. Isolation was carried out using PDA medium (for
fungi) and nutrient agar (for bacteria), followed by purification. Morphological characterization allowed
observation of reproductive structures such as microconidia, macroconidia, and chlamydospores in the
case of the fungus, as well as determination of Gram reaction and cell morphology in the bacteria. For
molecular identification, the ITS region was amplified and sequenced for fungi, and the 16S rRNA gene
for bacteria. The results revealed the presence of Fusarium oxysporum with 99.85% similarity and 100%
identity (accession MN417196.1), and Enterobacter hormaechei with 99.80% similarity and 100%
identity (accession CP017186.1). The accurate identification of these pathogens will allow the
development of more effective and environmentally responsible phytosanitary management strategies.
Keywords: isolation, pathogens, wilting, Solanaceae
Artículo recibido 15 marzo 2025
Aceptado para publicación: 15 abril 2025
pág. 1246
INTRODUCCIÓN
Nicotiana tabacum L., es uno de los cultivos agrícolas no alimentarios de mayor impacto económico a
nivel mundial de las que solo se comercializa su hoja (Berbeć & Matyka, 2020; García-Bernal
et al., 2025). Su producción se ve comprometida por la presencia de enfermedades fúngicas, bacterianas,
nematológicas y virales (Oliveira Rosa et al., 2025) que afectan raíces, tallos y hojas en distintas etapas
del desarrollo, causando síntomas de marchitez, necrosis, decoloración, retraso en el crecimiento e
incluso la muerte de las plantas (Tong et al., 2024)
Con el objetivo de reducir las pérdidas, se han adoptado diversas estrategias como la rotación de cultivos,
tratamientos químicos, mejoramiento genético, control biológico e identificaron molecular (Tong et al.,
2024). En Ecuador los estudios enfocados en la identificación de agentes causales de enfermedades en
los cultivos son escasos, lo cual dificulta el reconocimiento oportuno, y conlleva a la aplicación de
prácticas de manejo inadecuadas (Espinoza Castro et al., 2023).
La identificación precisa de fitopatógenos es crucial para implementar estrategias efectivas de manejo
en los cultivos. Inicialmente, se recurre a la caracterización morfológica, observando características
coloniales en medios de cultivo específicos y evaluando la morfología celular mediante tinción de Gram
y análisis microscópico, lo que permite una clasificación preliminar (Agarwal et al., 2020). Debido a
que muchas especies pueden presentar morfologías similares, se requiere complementar con técnicas
moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando genes conservados como el
16S rRNA para bacterias o la región ITS en hongos, lo que permite una identificación más precisa
mediante análisis filogenéticos (Weisburg et al., 1991).
El objetivo de este estudio fue aislar e identificar, mediante análisis morfológicos y moleculares, al
agente causal de la pudrición del tallo en Nicotiana tabacum L., a partir de muestras recolectadas en la
Tabacalera San Carlos, con el propósito de establecer una base sólida que contribuya a un manejo
fitosanitario más eficiente en el cultivo.
METODOLOGÍA
La investigación se desarrolló bajo un enfoque cuantitativo, de tipo descriptivo y de diseño experimental.
El estudio se realizó en condiciones controladas, la población de estudio correspondió a plantas con
síntomas visibles de enfermedades radiculares y foliares.
INTRODUCCIÓN
Nicotiana tabacum L., es uno de los cultivos agrícolas no alimentarios de mayor impacto económico a
nivel mundial de las que solo se comercializa su hoja (Berbeć & Matyka, 2020; García-Bernal
et al., 2025). Su producción se ve comprometida por la presencia de enfermedades fúngicas, bacterianas,
nematológicas y virales (Oliveira Rosa et al., 2025) que afectan raíces, tallos y hojas en distintas etapas
del desarrollo, causando síntomas de marchitez, necrosis, decoloración, retraso en el crecimiento e
incluso la muerte de las plantas (Tong et al., 2024)
Con el objetivo de reducir las pérdidas, se han adoptado diversas estrategias como la rotación de cultivos,
tratamientos químicos, mejoramiento genético, control biológico e identificaron molecular (Tong et al.,
2024). En Ecuador los estudios enfocados en la identificación de agentes causales de enfermedades en
los cultivos son escasos, lo cual dificulta el reconocimiento oportuno, y conlleva a la aplicación de
prácticas de manejo inadecuadas (Espinoza Castro et al., 2023).
La identificación precisa de fitopatógenos es crucial para implementar estrategias efectivas de manejo
en los cultivos. Inicialmente, se recurre a la caracterización morfológica, observando características
coloniales en medios de cultivo específicos y evaluando la morfología celular mediante tinción de Gram
y análisis microscópico, lo que permite una clasificación preliminar (Agarwal et al., 2020). Debido a
que muchas especies pueden presentar morfologías similares, se requiere complementar con técnicas
moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando genes conservados como el
16S rRNA para bacterias o la región ITS en hongos, lo que permite una identificación más precisa
mediante análisis filogenéticos (Weisburg et al., 1991).
El objetivo de este estudio fue aislar e identificar, mediante análisis morfológicos y moleculares, al
agente causal de la pudrición del tallo en Nicotiana tabacum L., a partir de muestras recolectadas en la
Tabacalera San Carlos, con el propósito de establecer una base sólida que contribuya a un manejo
fitosanitario más eficiente en el cultivo.
METODOLOGÍA
La investigación se desarrolló bajo un enfoque cuantitativo, de tipo descriptivo y de diseño experimental.
El estudio se realizó en condiciones controladas, la población de estudio correspondió a plantas con
síntomas visibles de enfermedades radiculares y foliares.
pág. 1247
Recolección de muestras
La recolección se llevó a cabo en una plantación de tabaco perteneciente a la Tabacalera San Carlos,
ubicada en la parroquia San Carlos, cantón Quevedo, provincia de Los Ríos (Ecuador). En el sitio se
identificó un lote de plantas con síntomas evidentes de marchitamiento, necrosis y pudrición de raíces y
tallos. Se seleccionaron varias plantas completas con dichos signos, las cuales fueron colocadas en
fundas Ziploc, rotuladas con fecha y características observadas, y luego transportadas al Laboratorio de
Biotecnología y Microbiología de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ).
Para la identificación morfológica, las muestras fueron procesadas en dicho laboratorio, mientras que
para la identificación molecular fueron enviadas al laboratorio IDGen, en la ciudad de Quito, donde se
realizaron la extracción de ADN, la amplificación por PCR, la secuenciación y el análisis
bioinformático.
Aislamiento de agentes patogénicos
La parte seleccionada del material vegetal a usar fueron los tallos, se realizaron cortes de cinco
centímetros y posterior a ello se realizó una desinfección superficial con hipoclorito de sodio al 1% por
1 minuto y luego se enjuago tres veces con agua destilada estéril. Los fragmentos de tallos fueron
depositados en dos medios de cultivos, PDA (hongos) y Agar nutritivo (bacterias). Se incubo a una
temperatura de 26 ± 2 °C por 5 a 7 días, tiempo donde se puede observar el crecimiento de colonias.
Purificación de cultivos
Se seleccionaron colonias representativas para replicar en nuevas cajas Petri con medios de cultivos
frescos, y se incubó bajo condiciones óptimas de temperatura. Tras la incubación, se verificó que la
nueva placa contenga solo una colonia predominante, lo que indica que el cultivo está puro. Si se
detectaba contaminación, se repetía el proceso hasta obtener cultivos puros.
Cultivo en medio CPG y caracterización colonial
Las bacterias patógenas purificadas fueron inoculadas en medio líquido CPG (10 g/L de bactopeptona,
1 g/L de extracto de levadura, 1 g/L de casaminoácidos y 2.5 mL de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio
al 1%) según Khokhani et al. (2018) Las inoculaciones se realizaron en tubos de ensayo, que fueron
incubados a 28 °C durante 48 horas. Posteriormente, se evaluaron características macroscópicas como
Recolección de muestras
La recolección se llevó a cabo en una plantación de tabaco perteneciente a la Tabacalera San Carlos,
ubicada en la parroquia San Carlos, cantón Quevedo, provincia de Los Ríos (Ecuador). En el sitio se
identificó un lote de plantas con síntomas evidentes de marchitamiento, necrosis y pudrición de raíces y
tallos. Se seleccionaron varias plantas completas con dichos signos, las cuales fueron colocadas en
fundas Ziploc, rotuladas con fecha y características observadas, y luego transportadas al Laboratorio de
Biotecnología y Microbiología de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo (UTEQ).
Para la identificación morfológica, las muestras fueron procesadas en dicho laboratorio, mientras que
para la identificación molecular fueron enviadas al laboratorio IDGen, en la ciudad de Quito, donde se
realizaron la extracción de ADN, la amplificación por PCR, la secuenciación y el análisis
bioinformático.
Aislamiento de agentes patogénicos
La parte seleccionada del material vegetal a usar fueron los tallos, se realizaron cortes de cinco
centímetros y posterior a ello se realizó una desinfección superficial con hipoclorito de sodio al 1% por
1 minuto y luego se enjuago tres veces con agua destilada estéril. Los fragmentos de tallos fueron
depositados en dos medios de cultivos, PDA (hongos) y Agar nutritivo (bacterias). Se incubo a una
temperatura de 26 ± 2 °C por 5 a 7 días, tiempo donde se puede observar el crecimiento de colonias.
Purificación de cultivos
Se seleccionaron colonias representativas para replicar en nuevas cajas Petri con medios de cultivos
frescos, y se incubó bajo condiciones óptimas de temperatura. Tras la incubación, se verificó que la
nueva placa contenga solo una colonia predominante, lo que indica que el cultivo está puro. Si se
detectaba contaminación, se repetía el proceso hasta obtener cultivos puros.
Cultivo en medio CPG y caracterización colonial
Las bacterias patógenas purificadas fueron inoculadas en medio líquido CPG (10 g/L de bactopeptona,
1 g/L de extracto de levadura, 1 g/L de casaminoácidos y 2.5 mL de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio
al 1%) según Khokhani et al. (2018) Las inoculaciones se realizaron en tubos de ensayo, que fueron
incubados a 28 °C durante 48 horas. Posteriormente, se evaluaron características macroscópicas como
pág. 1248
la turbidez, coloración del medio por reducción del tetrazolio, y formación de sedimento, como parte de
la caracterización colonial.
Caracterización morfológica
Para la identificación morfológica de los hongos, se preparó una suspensión de esporas utilizando agua
destilada estéril y un asa microbiológica para cubrir completamente la placa colonizada. La suspensión
fue teñida con azul de tripán para facilitar la observación de las estructuras reproductivas como
macroconidios, microconidios y clamidosporas (Murugan et al., 2020) La muestra fue colocada en un
portaobjetos y visualizada bajo un microscopio a 40X con aceite de inmersión para una observación
detallada.
En la identificación morfológica de las bacterias se realizó un frotis bacteriano de las colonias puras
sobre portaobjetos utilizando una pipeta estéril para transferir una pequeña cantidad de la colonia
seleccionada. Con la ayuda de un asa bacteriológica estéril, se extendió la muestra de forma uniforme
sobre el portaobjetos, asegurando que quedara una capa delgada de bacterias. Posteriormente, el frotis
se sometió a una tinción de Gram. Para ello, se aplicaron los reactivos correspondientes (cristal violeta,
yodo, alcohol y safranina) siguiendo el protocolo estándar de la tinción descrita por López-Jácome at al.
(2014). Después de la tinción, se dejó secar el portaobjetos y se observó bajo el microscopio óptico
utilizando un lente de 100X con aceite de inmersión para un mejor enfoque. Esta tinción permitió
determinar si las bacterias eran Gram positivas (color púrpura) o Gram negativas (color rosado).
Caracterización molecular
La identificación molecular de los aislados bacterianos y fúngicos fue realizada en el laboratorio IDGEN
(Quito, Ecuador), especializado en análisis genético. Para ello, se empleó la técnica de barcoding
molecular, utilizando los genes 16S rRNA para bacterias y EF1-α para hongos. Las muestras procesadas
incluyeron cultivos bacterianos líquidos y aislados fúngicos en cajas Petri. La extracción de ADN se
realizó por métodos convencionales a partir de 100 mg de muestra.
La calidad e integridad del ADN extraído fue evaluada mediante espectrofotometría de microvolúmenes
y electroforesis en gel de agarosa. El ADN se diluyó hasta una concentración de 20 ng/μL antes de su
amplificación mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), utilizando los primers universales
la turbidez, coloración del medio por reducción del tetrazolio, y formación de sedimento, como parte de
la caracterización colonial.
Caracterización morfológica
Para la identificación morfológica de los hongos, se preparó una suspensión de esporas utilizando agua
destilada estéril y un asa microbiológica para cubrir completamente la placa colonizada. La suspensión
fue teñida con azul de tripán para facilitar la observación de las estructuras reproductivas como
macroconidios, microconidios y clamidosporas (Murugan et al., 2020) La muestra fue colocada en un
portaobjetos y visualizada bajo un microscopio a 40X con aceite de inmersión para una observación
detallada.
En la identificación morfológica de las bacterias se realizó un frotis bacteriano de las colonias puras
sobre portaobjetos utilizando una pipeta estéril para transferir una pequeña cantidad de la colonia
seleccionada. Con la ayuda de un asa bacteriológica estéril, se extendió la muestra de forma uniforme
sobre el portaobjetos, asegurando que quedara una capa delgada de bacterias. Posteriormente, el frotis
se sometió a una tinción de Gram. Para ello, se aplicaron los reactivos correspondientes (cristal violeta,
yodo, alcohol y safranina) siguiendo el protocolo estándar de la tinción descrita por López-Jácome at al.
(2014). Después de la tinción, se dejó secar el portaobjetos y se observó bajo el microscopio óptico
utilizando un lente de 100X con aceite de inmersión para un mejor enfoque. Esta tinción permitió
determinar si las bacterias eran Gram positivas (color púrpura) o Gram negativas (color rosado).
Caracterización molecular
La identificación molecular de los aislados bacterianos y fúngicos fue realizada en el laboratorio IDGEN
(Quito, Ecuador), especializado en análisis genético. Para ello, se empleó la técnica de barcoding
molecular, utilizando los genes 16S rRNA para bacterias y EF1-α para hongos. Las muestras procesadas
incluyeron cultivos bacterianos líquidos y aislados fúngicos en cajas Petri. La extracción de ADN se
realizó por métodos convencionales a partir de 100 mg de muestra.
La calidad e integridad del ADN extraído fue evaluada mediante espectrofotometría de microvolúmenes
y electroforesis en gel de agarosa. El ADN se diluyó hasta una concentración de 20 ng/μL antes de su
amplificación mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), utilizando los primers universales
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27F/1492R para el gen 16S rRNA en bacterias (Weisburg et al., 1991) y EF1/EF2 para el gen EF1-α en
hongos (O’Donnell et al., 1998).
Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados mediante el método Sanger. Posteriormente,
las secuencias fueron limpiadas y ensambladas con software bioinformático especializado.
Análisis de datos
La identificación taxonómica se realizó mediante comparación con la base de datos de nucleótidos del
GenBank del NCBI, utilizando el algoritmo BLAST Las secuencias de mayor calidad fueron
seleccionadas para el ensamblaje final, y aquellas con baja cobertura o calidad fueron excluidas del
análisis. Para la identificación de hongos, se emplearon secuencias del marcador EF1-α, mientras que
para las bacterias se utilizó el marcador 16S rRNA. Una vez identificados los patógenos, se procedió a
la interpretación de los resultados para determinar la presencia de estos agentes en las muestras de
cultivo.
RESULTADOS
Caracterización morfológica
Los aislamientos fúngicos realizados en medio de cultivo PDA mostraron un crecimiento micelial denso
con textura algodonosa, inicialmente de tonalidad blanco-púrpura. A medida que avanzó la incubación,
se intensificó la pigmentación púrpura en la zona central de las colonias, mientras que los márgenes
conservaron una coloración más clara (Figura 1; Tabla 1), características compatibles con especies del
género Fusarium.
En cuanto a los aislamientos bacterianos, la prueba de tinción de Gram reveló bacilos Gram negativos,
evidenciados por la coloración rojiza (Figura 2A). Adicionalmente, la prueba con cloruro de
trifeniltetrazolio (TTC) mostró un cambio a rojo intenso (Figura 2B), indicando la capacidad de reducir
este compuesto, una propiedad típica de enterobacterias. Las colonias observadas en medio nutritivo
presentaron forma circular, superficie lisa, bordes regulares y tamaño pequeño (Figura 2C),
características coherentes con bacterias del grupo Enterobacteriaceae.
27F/1492R para el gen 16S rRNA en bacterias (Weisburg et al., 1991) y EF1/EF2 para el gen EF1-α en
hongos (O’Donnell et al., 1998).
Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados mediante el método Sanger. Posteriormente,
las secuencias fueron limpiadas y ensambladas con software bioinformático especializado.
Análisis de datos
La identificación taxonómica se realizó mediante comparación con la base de datos de nucleótidos del
GenBank del NCBI, utilizando el algoritmo BLAST Las secuencias de mayor calidad fueron
seleccionadas para el ensamblaje final, y aquellas con baja cobertura o calidad fueron excluidas del
análisis. Para la identificación de hongos, se emplearon secuencias del marcador EF1-α, mientras que
para las bacterias se utilizó el marcador 16S rRNA. Una vez identificados los patógenos, se procedió a
la interpretación de los resultados para determinar la presencia de estos agentes en las muestras de
cultivo.
RESULTADOS
Caracterización morfológica
Los aislamientos fúngicos realizados en medio de cultivo PDA mostraron un crecimiento micelial denso
con textura algodonosa, inicialmente de tonalidad blanco-púrpura. A medida que avanzó la incubación,
se intensificó la pigmentación púrpura en la zona central de las colonias, mientras que los márgenes
conservaron una coloración más clara (Figura 1; Tabla 1), características compatibles con especies del
género Fusarium.
En cuanto a los aislamientos bacterianos, la prueba de tinción de Gram reveló bacilos Gram negativos,
evidenciados por la coloración rojiza (Figura 2A). Adicionalmente, la prueba con cloruro de
trifeniltetrazolio (TTC) mostró un cambio a rojo intenso (Figura 2B), indicando la capacidad de reducir
este compuesto, una propiedad típica de enterobacterias. Las colonias observadas en medio nutritivo
presentaron forma circular, superficie lisa, bordes regulares y tamaño pequeño (Figura 2C),
características coherentes con bacterias del grupo Enterobacteriaceae.
pág. 1250
Tabla 1. Características fenotípicas del hongo aislado
Cepa Micelio Coloración Grupo
aromático
Forma de
macroconidias
Forma de
microconidias
Fosc 1 Algodonoso
Blanca con
pigmentación
violeta
Odoratum Ligeramente
curvos Ovalados
Figura 1. Observación Macroscópica y Microscópica de las características morfológicas de las cepas
fúngicas aisladas
Nota: Crecimiento de las colonias (a y b), características morfológicas de los microconidios (c), macroconidios (d) y
clamidósporas (e) del hongo Fusarium aislado de plantas de tabaco.
Figura 2. Resultados de tinción de Gram (A) morfología de la colonia (B) y morfología de la bacteria
Identificación molecular
El ADN genómico fue extraído con éxito a partir de cultivos puros. La calidad e integridad del ADN se
comprobó mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. La amplificación por PCR
generó bandas claras y definidas: aproximadamente 850 pb para hongos con el marcador EF1-α y 1500
pb para bacterias con el marcador 16S rRNA (Figura 3). Posteriormente, los productos fueron
Tabla 1. Características fenotípicas del hongo aislado
Cepa Micelio Coloración Grupo
aromático
Forma de
macroconidias
Forma de
microconidias
Fosc 1 Algodonoso
Blanca con
pigmentación
violeta
Odoratum Ligeramente
curvos Ovalados
Figura 1. Observación Macroscópica y Microscópica de las características morfológicas de las cepas
fúngicas aisladas
Nota: Crecimiento de las colonias (a y b), características morfológicas de los microconidios (c), macroconidios (d) y
clamidósporas (e) del hongo Fusarium aislado de plantas de tabaco.
Figura 2. Resultados de tinción de Gram (A) morfología de la colonia (B) y morfología de la bacteria
Identificación molecular
El ADN genómico fue extraído con éxito a partir de cultivos puros. La calidad e integridad del ADN se
comprobó mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. La amplificación por PCR
generó bandas claras y definidas: aproximadamente 850 pb para hongos con el marcador EF1-α y 1500
pb para bacterias con el marcador 16S rRNA (Figura 3). Posteriormente, los productos fueron
pág. 1251
secuenciados mediante el método Sanger, y las secuencias ensambladas se compararon con la base de
datos GenBank del NCBI utilizando el algoritmo BLAST, lo cual permitió determinar la identidad
específica de los aislados (Tabla 2)
Figura 3. Gel de agarosa al 1% con productos de PCR para A) marcador EF1-α (~850 pb) y B) marcador
16S (~1500 pb)
Nota: MM = marcador de peso molecular; CN = control negativo EF1-α; CN = control negativo 16S.
Tabla 2. Resultados de la identificación molecular de aislamientos fúngico y bacteriano mediante
comparación en GenBank
Código Tipo de
aislamiento
Procedencia
de la
muestra
Numero de
accesión
(GenBank)
Max.
punt.
Iden.
Máx.
Identificación
final
Fosc 1 Hongo
(Fusarium)
Tabacalera
San Carlos MN417196.1 99.85
% 100 % Fusarium
oxysporum
Bac 1 Bacteria
(Enterobacteria)
Tabacalera
San Carlos CP017186.1 99.80
% 100 % Enterobacteria
homaechei
DISCUSIÓN
La caracterización morfológica de los aislamientos fúngicos reveló características compatibles con
especies del género Fusarium, evidenciadas por la textura algodonosa y de tonalidades purpuras en el
centro, estas observaciones coinciden con Murugan et al. (2020), quienes describen los aislamientos de
Fusarium con micelio blanco a rosado y pigmentaciones púrpuras o anaranjadas, así como estructuras
esporales similares: macroconidios de forma de hoz con 3 a 5 septos y microconidios ovalados y
unicelulares. De manera similar, un estudio realizado en cultivos de Nicotiana tabacum en la provincia
de Granma, Cuba, se caracterizó aislamientos de Fusarium teniendo variabilidad en la pigmentación
sobre medio PDA, desde blanco hasta cremoso y violeta, además de colonias con textura algodonosa,
bordes regulares y formación de macroconidios de tamaño comparable (Sosa Sánchez et al., 2022).
secuenciados mediante el método Sanger, y las secuencias ensambladas se compararon con la base de
datos GenBank del NCBI utilizando el algoritmo BLAST, lo cual permitió determinar la identidad
específica de los aislados (Tabla 2)
Figura 3. Gel de agarosa al 1% con productos de PCR para A) marcador EF1-α (~850 pb) y B) marcador
16S (~1500 pb)
Nota: MM = marcador de peso molecular; CN = control negativo EF1-α; CN = control negativo 16S.
Tabla 2. Resultados de la identificación molecular de aislamientos fúngico y bacteriano mediante
comparación en GenBank
Código Tipo de
aislamiento
Procedencia
de la
muestra
Numero de
accesión
(GenBank)
Max.
punt.
Iden.
Máx.
Identificación
final
Fosc 1 Hongo
(Fusarium)
Tabacalera
San Carlos MN417196.1 99.85
% 100 % Fusarium
oxysporum
Bac 1 Bacteria
(Enterobacteria)
Tabacalera
San Carlos CP017186.1 99.80
% 100 % Enterobacteria
homaechei
DISCUSIÓN
La caracterización morfológica de los aislamientos fúngicos reveló características compatibles con
especies del género Fusarium, evidenciadas por la textura algodonosa y de tonalidades purpuras en el
centro, estas observaciones coinciden con Murugan et al. (2020), quienes describen los aislamientos de
Fusarium con micelio blanco a rosado y pigmentaciones púrpuras o anaranjadas, así como estructuras
esporales similares: macroconidios de forma de hoz con 3 a 5 septos y microconidios ovalados y
unicelulares. De manera similar, un estudio realizado en cultivos de Nicotiana tabacum en la provincia
de Granma, Cuba, se caracterizó aislamientos de Fusarium teniendo variabilidad en la pigmentación
sobre medio PDA, desde blanco hasta cremoso y violeta, además de colonias con textura algodonosa,
bordes regulares y formación de macroconidios de tamaño comparable (Sosa Sánchez et al., 2022).
pág. 1252
Los aislados bacterianos mostraron características propias de Enterobacterias, como la coloración Gram
negativa y la reducción del TTC, lo cual concuerda con lo señalado por Retana et al., (2019) quienes
identificaron a Enterobacter hormaechei como agente causal de pudriciones en tallos de Hylocereus
costaricensis, las bacterias presentaron forma de bacilos, reacción catalasa positiva, oxidasa negativa y
capacidad para fermentar carbohidratos con producción de gas. Asimismo, Puerta y Mateos (2010)
describen a las enterobacterias como organismos móviles, aerobios facultativos y capaces de fermentar
glucosa. Por otro lado, la bacteria exhibió una forma completa y circular con tamaño reducido, lo cual
concuerda con la morfología típica de especies del género Enterobacter (Morales-López et al., 2019).
Respecto al análisis molecular, la obtención de una banda de aproximadamente 859 pares de bases tras
la amplificación con cebadores específicos para hongos indica la existencia de ADN característico del
género Fusarium en la muestra evaluada (Salazar-González et al., 2016), lo cual corrobora la
identificación molecular y apunta a que el hongo aislado corresponde al género Fusarium, coincidiendo
particularmente con las características atribuidas a la raza 1 de F. oxysporum f. sp. lycopersici, descritas
por Kleczewski y Egel (2011). Por otro lado, la identificación de la bacteria se fortaleció mediante PCR
con primers dirigidos al gen 16S, lo que permitió confirmar la presencia de bacterias del género
Enterobacter en la muestra analizada (Retana-Sánchez et al., 2019). La morfología es una herramienta
útil para una aproximación inicial en la identificación de patógenos, dada la posible similitud entre
especies morfológicamente cercanas, se hace evidente complementarlo con herramientas moleculares.
CONCLUSIÓN
La caracterización morfológica y molecular del agente causal de la pudrición del tallo en Nicotiana
tabacum L. permitió identificar con mayor precisión el patógeno involucrado, asociado a los síntomas
observados en campo. Mientras que el análisis morfológico facilitó la observación de las estructuras y
características generales del microorganismo, la caracterización molecular confirmó su identidad a nivel
de especie, diferenciándolo dentro de un género que puede incluir múltiples variantes. Esta
identificación precisa es fundamental para que los agricultores apliquen estrategias de control
fitosanitario de forma oportuna y responsable, minimizando impactos negativos sobre el ambiente y
contribuyendo a un mejor manejo en la sanidad del cultivo.
Los aislados bacterianos mostraron características propias de Enterobacterias, como la coloración Gram
negativa y la reducción del TTC, lo cual concuerda con lo señalado por Retana et al., (2019) quienes
identificaron a Enterobacter hormaechei como agente causal de pudriciones en tallos de Hylocereus
costaricensis, las bacterias presentaron forma de bacilos, reacción catalasa positiva, oxidasa negativa y
capacidad para fermentar carbohidratos con producción de gas. Asimismo, Puerta y Mateos (2010)
describen a las enterobacterias como organismos móviles, aerobios facultativos y capaces de fermentar
glucosa. Por otro lado, la bacteria exhibió una forma completa y circular con tamaño reducido, lo cual
concuerda con la morfología típica de especies del género Enterobacter (Morales-López et al., 2019).
Respecto al análisis molecular, la obtención de una banda de aproximadamente 859 pares de bases tras
la amplificación con cebadores específicos para hongos indica la existencia de ADN característico del
género Fusarium en la muestra evaluada (Salazar-González et al., 2016), lo cual corrobora la
identificación molecular y apunta a que el hongo aislado corresponde al género Fusarium, coincidiendo
particularmente con las características atribuidas a la raza 1 de F. oxysporum f. sp. lycopersici, descritas
por Kleczewski y Egel (2011). Por otro lado, la identificación de la bacteria se fortaleció mediante PCR
con primers dirigidos al gen 16S, lo que permitió confirmar la presencia de bacterias del género
Enterobacter en la muestra analizada (Retana-Sánchez et al., 2019). La morfología es una herramienta
útil para una aproximación inicial en la identificación de patógenos, dada la posible similitud entre
especies morfológicamente cercanas, se hace evidente complementarlo con herramientas moleculares.
CONCLUSIÓN
La caracterización morfológica y molecular del agente causal de la pudrición del tallo en Nicotiana
tabacum L. permitió identificar con mayor precisión el patógeno involucrado, asociado a los síntomas
observados en campo. Mientras que el análisis morfológico facilitó la observación de las estructuras y
características generales del microorganismo, la caracterización molecular confirmó su identidad a nivel
de especie, diferenciándolo dentro de un género que puede incluir múltiples variantes. Esta
identificación precisa es fundamental para que los agricultores apliquen estrategias de control
fitosanitario de forma oportuna y responsable, minimizando impactos negativos sobre el ambiente y
contribuyendo a un mejor manejo en la sanidad del cultivo.
pág. 1253
Agradecimientos
Se agradece a la Universidad Técnica Estatal de Quevedo por facilitar el uso de los laboratorios de
Biotecnología y Microbiología indispensables para el desarrollo de esta investigación. También se
expresa un especial reconocimiento a los encargados de laboratorio por su valiosa asistencia técnica y a
la Tabacalera San Carlos por su colaboración en la realización del muestreo en campo.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Agarwal, H., Dowarah, B., & Agarwala, N. (2020). A Quick Method for Screening Biocontrol Efficacy
of Bacterial Isolates Against Bacterial Wilt Pathogen Ralstonia solanacearum in Tomato. BIO-
PROTOCOL, 10(22). https://doi.org/10.21769/BioProtoc.3829
Berbeć, A., & Matyka, M. (2020). Biomass Characteristics and Energy Yields of Tobacco (Nicotiana
tabacum L.) Cultivated in Eastern Poland. Agriculture, 10, 551.
https://doi.org/10.3390/agriculture10110551
Espinoza Castro, M. F., Rivera Casignia, Á. M., Rivas Figueroa, F. J., & Leiva Mora, M. (2023).
Identificación y caracterización morfológica de hongos asociados a daños en tuna (Opuntia ficus-
indica), en la provincia de Chimborazo, Ecuador. Bionatura, 8(3), 1-10.
https://doi.org/10.21931/RB/2023.08.03.14
García-Bernal, M., Medina-Marrero, R., Hernández, L. C., Hernández, U. Á., Ojeda-Silvera, C. M.,
Batista-Sánchez, D., & Mazón-Suástegui, J. M. (2025). Actinomicetos Promueven Crecimiento
en Plántulas de Nicotiana tabacum L. Revista terra latinoamericana, 43.
https://doi.org/10.28940/terralatinoamericana.v43i.1981
Khokhani, D., Tran, T. M., Lowe-Power, T. M., & Allen, C. (2018). Plant Assays for Quantifying
Ralstonia solanacearum Virulence. Bio-Protocol, 8(18). https://doi.org/10.21769/BioProtoc.3028
Kleczewski, N. M., & Egel, D. S. (2011). A Diagnostic Guide for Fusarium Wilt of Watermelon. Plant
Health Progress, 12(1), 27. https://doi.org/10.1094/PHP-2011-1129-01-DG
López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S., Cerón-González, G.,
& Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
Agradecimientos
Se agradece a la Universidad Técnica Estatal de Quevedo por facilitar el uso de los laboratorios de
Biotecnología y Microbiología indispensables para el desarrollo de esta investigación. También se
expresa un especial reconocimiento a los encargados de laboratorio por su valiosa asistencia técnica y a
la Tabacalera San Carlos por su colaboración en la realización del muestreo en campo.
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pág. 1254
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century: A review focused on taxonomic changes. J Infect Dev Ctries 2, 13(4), 265-273.
https://doi.org/doi:10.3855/jidc.11216
Murugan, L., Krishnan, N., Venkataravanappa, V., Saha, S., Mishra, A. K., Sharma, B. K., & Rai, A. B.
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020-02475-z
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fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial
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Oliveira Rosa, I. G., Ferreira Fernandes, F. I., Xavier Dourado, C. G., Figueroa Cossio, L. X., & Silva
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causada por Cercospora nicotianae. Observatorio de la economía latinoamericana, 23(2), e8927-
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Fusarium asociado a pudrición basal del fruto en pitahaya (Selenicereus megalanthus )1.
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identificación de Fusarium spp., asociado a Nicotiana tabacum L. Agronomía Costarricense.
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transcriptoma dinámico revela patrones de respuesta a la enfermedad de la pierna negra en el
tabaco (Nicotiana tabacum L.). Plant Stress, 14, 100676.
https://doi.org/10.1016/j.stress.2024.100676
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for phylogenetic study. Journal of Bacteriology, 173(2), 697-703.
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