CARACTERIZACIÓN METAGENÓMICA DE CEPAS
RESISTENTES A AGENTES QUÍMICOS Y SU
UTILIDAD PROBIÓTICA CONTRA VIBRIOS
PARAHAEMOLYTICUS
METAGENOMIC CHARACTERIZATION OF STRAINS
RESISTANT TO CHEMICAL AGENTS AND THEIR PROBIOTIC
UTILITY AGAINST VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
Angela María Reyes Lainez
Universidad estatal Península de Santa Elena
Maria Belén Castillo Narea
Universidad Católica de Cuenca
David Israel Bravo Crespo
Universidad Católica de Cuenca
Milton Senen Barcos Arias
Universidad de Guayaquil
Julian Calderon
TIBALLOSA
pág. 4116
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i3.18045
Caracterización metagenómica de cepas resistentes a agentes químicos y su
utilidad probiótica contra vibrios parahaemolyticus
Angela María Reyes Lainez1
anmaria.reyes@hotmail.com
https://orcid.org/0009-0005-8283-1194
Universidad estatal Península de Santa Elena
Ecuador
Maria Belén Castillo Narea
mabelpio0706@gmail.com
https://orcid.org/0009-0003-8486-0605
Universidad Católica de Cuenca
Ecuador
David Israel Bravo Crespo
davidisraelbc@hotmail.com
https://orcid.org/0000-0001-5131-4120
Universidad Católica de Cuenca
Ecuador
Milton Senen Barcos Arias
milton.barcosa@ug.edu.ec
https://orcid.org/0000-0003-0863-6778
Universidad de Guayaquil
Ecuador
Julian Calderon
tiballosalrva1@gmail.cim
https://orcid.org/0009-0002-5409-5669
TIBALLOSA
Ecuador
RESUMEN
La acuicultura sufre importantes pérdidas económicas en los cultivos de camarón blanco (Litopenaeus
vannamei) debido a enfermedades de origen microbiano y viral, actualmente las enfermedades
provocadas por bacterias del género Vibrio han tomado impulso en los sistemas de cultivo de camarón,
y para combatirlo el uso de fármacos ha generado resistencia y enfermedades. El objetivo de esta
investigación fue estudiar la caracterización metagenómica del microbiota expuesto a agentes químicos
y comprobar la sensibilidad y utilidad probiótica contra vibrios parahaemolyticus en camarón blanco
(Litopenaeus vannamei). Las muestras se recolectaron de reservorios de agua de mar tratada con ozono,
las cuales fueron sembradas en agares generales y específicos, como agar Trypticasa soya (TSA);
Chromagar bacillus (CB) y Man Rugosa Shamr (MRS) para luego iniciar el proceso de selección
incubándose por 24 horas a 32°C. Se obtuvieron 2 consorcios bacterianos denominándolos CN5, RS3 y
una colonia formadora de biopelícula denominándola CINV. Para el análisis de las muestras, se utilizó
el protocolo otorgado por Ilumina para la preparación de librerías en la secuenciación metagenómica
16S, seguidamente realizando la evaluación de la actividad antagónica por la técnica de Kirby - Bauer
Los resultados que se obtuvieron en este estudio indican que se identificaron una microbiota rica y
compleja identificándose solo el 8,7% a nivel de especie con una abundancia del 100% de Bacillus sp,
mientras que para la muestra CINV hubo una abundancia de 99% de vibrios no presentes en la base de
datos de secuenciación. Las pruebas de inhibición in vitro muestran que la combinación de ambos
consorcios microbianos tuvo un 99% de porcentaje de inhibición contra V. parahaemolyticus y CINV.
Esta investigación servirá como línea base de estudio de bacterias salvajes con capacidad
antimicrobiana, siendo una ventaja a diferencia de varios estudios en los que se realizan investigaciones
a partir de esponjas marinas, corales donde se presentan limitaciones en cuanto a la disponibilidad de
estos organismos.
Palabras clave: probióticos, metagenómica, microbiota, sinergia
1 Autor principal.
Correspondencia: mabelpio0706@gmail.com
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i3.18045
Caracterización metagenómica de cepas resistentes a agentes químicos y su
utilidad probiótica contra vibrios parahaemolyticus
Angela María Reyes Lainez1
anmaria.reyes@hotmail.com
https://orcid.org/0009-0005-8283-1194
Universidad estatal Península de Santa Elena
Ecuador
Maria Belén Castillo Narea
mabelpio0706@gmail.com
https://orcid.org/0009-0003-8486-0605
Universidad Católica de Cuenca
Ecuador
David Israel Bravo Crespo
davidisraelbc@hotmail.com
https://orcid.org/0000-0001-5131-4120
Universidad Católica de Cuenca
Ecuador
Milton Senen Barcos Arias
milton.barcosa@ug.edu.ec
https://orcid.org/0000-0003-0863-6778
Universidad de Guayaquil
Ecuador
Julian Calderon
tiballosalrva1@gmail.cim
https://orcid.org/0009-0002-5409-5669
TIBALLOSA
Ecuador
RESUMEN
La acuicultura sufre importantes pérdidas económicas en los cultivos de camarón blanco (Litopenaeus
vannamei) debido a enfermedades de origen microbiano y viral, actualmente las enfermedades
provocadas por bacterias del género Vibrio han tomado impulso en los sistemas de cultivo de camarón,
y para combatirlo el uso de fármacos ha generado resistencia y enfermedades. El objetivo de esta
investigación fue estudiar la caracterización metagenómica del microbiota expuesto a agentes químicos
y comprobar la sensibilidad y utilidad probiótica contra vibrios parahaemolyticus en camarón blanco
(Litopenaeus vannamei). Las muestras se recolectaron de reservorios de agua de mar tratada con ozono,
las cuales fueron sembradas en agares generales y específicos, como agar Trypticasa soya (TSA);
Chromagar bacillus (CB) y Man Rugosa Shamr (MRS) para luego iniciar el proceso de selección
incubándose por 24 horas a 32°C. Se obtuvieron 2 consorcios bacterianos denominándolos CN5, RS3 y
una colonia formadora de biopelícula denominándola CINV. Para el análisis de las muestras, se utilizó
el protocolo otorgado por Ilumina para la preparación de librerías en la secuenciación metagenómica
16S, seguidamente realizando la evaluación de la actividad antagónica por la técnica de Kirby - Bauer
Los resultados que se obtuvieron en este estudio indican que se identificaron una microbiota rica y
compleja identificándose solo el 8,7% a nivel de especie con una abundancia del 100% de Bacillus sp,
mientras que para la muestra CINV hubo una abundancia de 99% de vibrios no presentes en la base de
datos de secuenciación. Las pruebas de inhibición in vitro muestran que la combinación de ambos
consorcios microbianos tuvo un 99% de porcentaje de inhibición contra V. parahaemolyticus y CINV.
Esta investigación servirá como línea base de estudio de bacterias salvajes con capacidad
antimicrobiana, siendo una ventaja a diferencia de varios estudios en los que se realizan investigaciones
a partir de esponjas marinas, corales donde se presentan limitaciones en cuanto a la disponibilidad de
estos organismos.
Palabras clave: probióticos, metagenómica, microbiota, sinergia
1 Autor principal.
Correspondencia: mabelpio0706@gmail.com
pág. 4117
Metagenomic characterization of strains resistant to chemical agents and
their probiotic utility against Vibrio parahaemolyticus
ABSTRACT
Aquaculture suffers significant economic losses in white shrimp (Litopenaeus vannamei) crops due to
diseases of microbial and viral origin. Currently, diseases caused by bacteria of the Vibrio genus have
gained momentum in shrimp farming systems, and to combat it the use of drugs has generated resistance
and diseases. The objective of this research was to study the metagenomic characterization of the
microbiota exposed to chemical agents and to verify the sensitivity and probiotic usefulness against
vibrios parahaemolyticus in white shrimp (Litopenaeus vannamei). Samples were collected from ozone-
treated seawater reservoirs, which were plated on general and specific agars, such as Trypticase soy agar
(TSA); Chromagar bacillus (CB) and Man Rugosa Shamr (MRS) and then begin the selection process
by incubating for 24 hours at 32°C. Two bacterial consortia were obtained, calling them CN5, RS3, and
a biofilm-forming colony, calling it CINV. For the analysis of the samples, the protocol granted by
Ilumina for the preparation of libraries in 16S metagenomic sequencing was used, followed by the
evaluation of the antagonistic activity by the Kirby-Bauer technique. The results obtained in this study
indicate that A rich and complex microbiota was identified, with only 8.7% identified at the species level
with a 100% abundance of Bacillus sp, while for the CINV sample there was a 99% abundance of vibrios
not present in the database of sequencing. In vitro inhibition tests show that the combination of both
microbial consortia had a 99% inhibition rate against V. parahaemolyticus and CINV. This research will
serve as a baseline for the study of wild bacteria with antimicrobial capacity, being an advantage unlike
several studies in which research is carried out using marine sponges and corals where there are
limitations regarding the availability of these organisms.
Keywords: probiotics, metagenomics, microbiota, synergy
Artículo recibido 15 mayo 2025
Aceptado para publicación: 19 junio 2025
Metagenomic characterization of strains resistant to chemical agents and
their probiotic utility against Vibrio parahaemolyticus
ABSTRACT
Aquaculture suffers significant economic losses in white shrimp (Litopenaeus vannamei) crops due to
diseases of microbial and viral origin. Currently, diseases caused by bacteria of the Vibrio genus have
gained momentum in shrimp farming systems, and to combat it the use of drugs has generated resistance
and diseases. The objective of this research was to study the metagenomic characterization of the
microbiota exposed to chemical agents and to verify the sensitivity and probiotic usefulness against
vibrios parahaemolyticus in white shrimp (Litopenaeus vannamei). Samples were collected from ozone-
treated seawater reservoirs, which were plated on general and specific agars, such as Trypticase soy agar
(TSA); Chromagar bacillus (CB) and Man Rugosa Shamr (MRS) and then begin the selection process
by incubating for 24 hours at 32°C. Two bacterial consortia were obtained, calling them CN5, RS3, and
a biofilm-forming colony, calling it CINV. For the analysis of the samples, the protocol granted by
Ilumina for the preparation of libraries in 16S metagenomic sequencing was used, followed by the
evaluation of the antagonistic activity by the Kirby-Bauer technique. The results obtained in this study
indicate that A rich and complex microbiota was identified, with only 8.7% identified at the species level
with a 100% abundance of Bacillus sp, while for the CINV sample there was a 99% abundance of vibrios
not present in the database of sequencing. In vitro inhibition tests show that the combination of both
microbial consortia had a 99% inhibition rate against V. parahaemolyticus and CINV. This research will
serve as a baseline for the study of wild bacteria with antimicrobial capacity, being an advantage unlike
several studies in which research is carried out using marine sponges and corals where there are
limitations regarding the availability of these organisms.
Keywords: probiotics, metagenomics, microbiota, synergy
Artículo recibido 15 mayo 2025
Aceptado para publicación: 19 junio 2025
pág. 4118
INTRODUCCIÓN
Hace cuatro décadas Ecuador dio inicio a la práctica comercial del cultivo de camarones en estanques,
su progreso y evolución en la economía local con mayor incidencia en la provincia del Guayas ha sido
de suma importancia, destacándose en los mercados mundiales y logrando que el camarón ecuatoriano
sea bien recibido a nivel mundial esto implica que el peso de las exportaciones no petroleras se
incrementó con la participación de las exportaciones de dos productos camarón y banano 1. La
producción de larvas de camarón con sus altas densidades de siembra ha ocasionado que frecuentemente
se lidien con enfermedades microbianas como vibriosis, causada por bacterias patógenas del género
Vibrio afectando etapas críticas del desarrollo ontogénico, a esta problemática se une el empleo de
antibióticos los mismos que deben ser excluidos por los múltiples problemas que causan en la
acuicultura como son la resistencia antibacteriana y la contaminación por el desecho inseguro de aguas
con estas sustancias 2.
Sin duda, los avances tecnológicos han contribuido significativamente a estos resultados y las
exportaciones de camarón lo reflejan, así pues, una serie de eventos, en su mayoría patológicas, tuvieron
diversos grados de impacto en la dinámica productiva, el impacto de white spot syndrome virus (WSSV)
en la acuicultura de Ecuador fue devastador, causando pérdidas económicas de millones de dólares y la
muerte de millones de peces 3. Las investigaciones sobre enfermedades infecciosas permiten desarrollar
terapias antimicrobianas eficaces, que podrán implementarse para mitigar los eventos futuros de
enfermedades infecciosas 4.
En la mayoría de las investigaciones donde se incluye información sobre el análisis de microorganismos
en la acuicultura, se utilizan metodologías basadas en la microscopía óptica, bioquímica o electroforesis
en gel con gradiente de desnaturalización5. Sin embargo, hoy en día existen técnicas de mayor
resolución; por ejemplo, técnica de secuenciación masiva o secuenciación de última generación del gen
16S ARNr6.
En este sentido, la metagenómica puede proporcionar una visión más profunda de estas relaciones
mediante la interpretación de la información revelada por el ADN extraído directamente del consorcio
de microorganismos presentes en los ambientes de cultivos acuícolas7.
INTRODUCCIÓN
Hace cuatro décadas Ecuador dio inicio a la práctica comercial del cultivo de camarones en estanques,
su progreso y evolución en la economía local con mayor incidencia en la provincia del Guayas ha sido
de suma importancia, destacándose en los mercados mundiales y logrando que el camarón ecuatoriano
sea bien recibido a nivel mundial esto implica que el peso de las exportaciones no petroleras se
incrementó con la participación de las exportaciones de dos productos camarón y banano 1. La
producción de larvas de camarón con sus altas densidades de siembra ha ocasionado que frecuentemente
se lidien con enfermedades microbianas como vibriosis, causada por bacterias patógenas del género
Vibrio afectando etapas críticas del desarrollo ontogénico, a esta problemática se une el empleo de
antibióticos los mismos que deben ser excluidos por los múltiples problemas que causan en la
acuicultura como son la resistencia antibacteriana y la contaminación por el desecho inseguro de aguas
con estas sustancias 2.
Sin duda, los avances tecnológicos han contribuido significativamente a estos resultados y las
exportaciones de camarón lo reflejan, así pues, una serie de eventos, en su mayoría patológicas, tuvieron
diversos grados de impacto en la dinámica productiva, el impacto de white spot syndrome virus (WSSV)
en la acuicultura de Ecuador fue devastador, causando pérdidas económicas de millones de dólares y la
muerte de millones de peces 3. Las investigaciones sobre enfermedades infecciosas permiten desarrollar
terapias antimicrobianas eficaces, que podrán implementarse para mitigar los eventos futuros de
enfermedades infecciosas 4.
En la mayoría de las investigaciones donde se incluye información sobre el análisis de microorganismos
en la acuicultura, se utilizan metodologías basadas en la microscopía óptica, bioquímica o electroforesis
en gel con gradiente de desnaturalización5. Sin embargo, hoy en día existen técnicas de mayor
resolución; por ejemplo, técnica de secuenciación masiva o secuenciación de última generación del gen
16S ARNr6.
En este sentido, la metagenómica puede proporcionar una visión más profunda de estas relaciones
mediante la interpretación de la información revelada por el ADN extraído directamente del consorcio
de microorganismos presentes en los ambientes de cultivos acuícolas7.
pág. 4119
Los probióticos, prebióticos y simbióticos son aditivos empleados para controlar enfermedades
bacterianas en camarón entre ellos destacan los probióticos, por ser una alternativa eficiente a los
antibióticos. La administración se realiza directa por vía oral a través del alimento, administrado de
manera indirecta al agua de cultivo, utilizando un medio fermentado8.
Una estrategia para combatir vibriosis es mediante cepas probióticas de origen marino9. Vibrio
parahaemolyticus (Vp) es una bacteria ubicua de importancia acuícola, la cual ha sido aislada en
muestras de agua de mar, sedimento; inclusive organismos marinos de interés comercial como peces,
crustáceos y moluscos 10. V. parahaemolyticus es una bacteria autóctona del tracto digestivo de
Litopenaeus vannamei, por lo que éste tiende a estar vulnerable ante las colonizaciones masivas de esta
bacteria11.
La biodiversidad de cepas probióticas que existen en el mercado para acuicultura pertenece al género
Bacillus, las mismas que pueden ser aisladas de suelo agua y en muchas ocasiones de ambientes
terrestres 12. En ocasiones su éxito en los cultivos marinos es cuestionable, debido en parte a los factores
ambientales (bacterias terrestres en medio marino) y al poco éxito de estos probióticos compitiendo
contra Vibrios sp. en los cultivos13. Estudios recientes utilizando metagenómica muestran que V.
parahaemolyticus (perteneciente al clado de V. harveyi) modifica la microbiota de los cultivos
disminuyendo la diversidad bacteriana en favor de los vibrios14.
Actualmente existen disponibles en el mercado varias marcas de Probióticos, en presentación líquida y
sólida, que contienen una variedad de bacilos, lactobacilos y enzimas con diferentes concentraciones de
unidades formadoras de colonias (UFC), la gran mayoría son activados en agua, fuente de carbono,
fuente de nitrógeno mientras que otros solo necesitan ser hidratados y aplicados directamente15.
Existe poca literatura acerca de la identificación metagenómica de consorcios microbianos salvajes que
entran al sistema de producción de larvas de camarón, por tal motivo resulta relevante la identificación
y su potencial uso como probiótico en la industria del camarón.
Con el fin de abordar esta problemática, resulta imperativo identificar y analizar a nivel molecular con
técnicas de última generación, como son la genómica desde la extracción del ADN, el estudio de cepas
probióticas nativas como agentes antimicrobianos mediante su evaluación in vitro contra vibrios sp, este
Los probióticos, prebióticos y simbióticos son aditivos empleados para controlar enfermedades
bacterianas en camarón entre ellos destacan los probióticos, por ser una alternativa eficiente a los
antibióticos. La administración se realiza directa por vía oral a través del alimento, administrado de
manera indirecta al agua de cultivo, utilizando un medio fermentado8.
Una estrategia para combatir vibriosis es mediante cepas probióticas de origen marino9. Vibrio
parahaemolyticus (Vp) es una bacteria ubicua de importancia acuícola, la cual ha sido aislada en
muestras de agua de mar, sedimento; inclusive organismos marinos de interés comercial como peces,
crustáceos y moluscos 10. V. parahaemolyticus es una bacteria autóctona del tracto digestivo de
Litopenaeus vannamei, por lo que éste tiende a estar vulnerable ante las colonizaciones masivas de esta
bacteria11.
La biodiversidad de cepas probióticas que existen en el mercado para acuicultura pertenece al género
Bacillus, las mismas que pueden ser aisladas de suelo agua y en muchas ocasiones de ambientes
terrestres 12. En ocasiones su éxito en los cultivos marinos es cuestionable, debido en parte a los factores
ambientales (bacterias terrestres en medio marino) y al poco éxito de estos probióticos compitiendo
contra Vibrios sp. en los cultivos13. Estudios recientes utilizando metagenómica muestran que V.
parahaemolyticus (perteneciente al clado de V. harveyi) modifica la microbiota de los cultivos
disminuyendo la diversidad bacteriana en favor de los vibrios14.
Actualmente existen disponibles en el mercado varias marcas de Probióticos, en presentación líquida y
sólida, que contienen una variedad de bacilos, lactobacilos y enzimas con diferentes concentraciones de
unidades formadoras de colonias (UFC), la gran mayoría son activados en agua, fuente de carbono,
fuente de nitrógeno mientras que otros solo necesitan ser hidratados y aplicados directamente15.
Existe poca literatura acerca de la identificación metagenómica de consorcios microbianos salvajes que
entran al sistema de producción de larvas de camarón, por tal motivo resulta relevante la identificación
y su potencial uso como probiótico en la industria del camarón.
Con el fin de abordar esta problemática, resulta imperativo identificar y analizar a nivel molecular con
técnicas de última generación, como son la genómica desde la extracción del ADN, el estudio de cepas
probióticas nativas como agentes antimicrobianos mediante su evaluación in vitro contra vibrios sp, este
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enfoque permitirá la implementación inmediata de un protocolo de control, con la finalidad de aplicar
medidas preventivas y mitigar posibles pérdidas en el desarrollo del ciclo de cultivo de camarón16 .
Con estos antecedentes se seleccionó las cepas bacterianas con características morfológicas típicas para
la clasificación de las bacterias en los grupos deseados para el aislamiento (Bacillus, Lactobacillus) la
forma de la colonia, la presencia de colonias con tonalidades cremosas, blancas y amarillas, bordes
completos, forma convexa, disposición redonda o irregular17.
En este contexto, la presente investigación tuvo como objetivo principal contribuir con la caracterización
metagenómica de la microbiota expuesta a agentes químicos y comprobar la sensibilidad y utilidad
probiótica contra vibrios parahaemolyticus en camarón blanco (Litopenaeus vannamei).
METODOLOGÍA
Recolección de las muestras de agua
El experimento se realizó en el laboratorio de producción de larvas de camarón TIBALLOSA en
Anconcito sector La Diablica, se recolecto muestras de agua de reservorio que tiene una capacidad de
400 toneladas la cual fue recolectada para la siembra de los nauplios de camarón, estas muestras de agua
fueron sometidos a tratamiento químico con ozono y fueron pasadas por bolsos filtrantes de 0,5 μm,
luego se mezclaron entre sí y se obtuvo una muestra patrón, posterior se colocó en un tubo falcón de 50
ml y se conservó la muestra 4°C hasta su respectivo análisis18.
Diseño del experimento
Para el estudio las muestras de agua de mar tratada con ozono fueron sembradas en agar Trypicasa soya
(TSA), agar Thiosulfato-Citrate-Bilis Sucrose (TCBS), agar Cetrimide; Chromagar Bacillus; Agar Man,
Rogosa y Sharpe (MRS). Se aislaron e identificaron los distintos morfotipos de las colonias en TSA al
2% de NaCl y se incubaron a 32°C por 48 horas para seleccionar la microbiota marina para otorgar un
periodo adicional destinado a la posible proliferación de nuevas colonias, ya que el tiempo podría ser
un factor crítico en el desarrollo bacteriano.
Se obtuvieron 2 consorcios bacterianos a los que se los denomino como RS3 y CN5 ambos fueron
puestos a crecer en medio de cultivo Trypticasa soya broth (TSB). Con el fin de determinar el efecto
probiótico de las cepas aisladas como son: CN5 y RS3 ambos aislados por triplicado se los sometió a
enfoque permitirá la implementación inmediata de un protocolo de control, con la finalidad de aplicar
medidas preventivas y mitigar posibles pérdidas en el desarrollo del ciclo de cultivo de camarón16 .
Con estos antecedentes se seleccionó las cepas bacterianas con características morfológicas típicas para
la clasificación de las bacterias en los grupos deseados para el aislamiento (Bacillus, Lactobacillus) la
forma de la colonia, la presencia de colonias con tonalidades cremosas, blancas y amarillas, bordes
completos, forma convexa, disposición redonda o irregular17.
En este contexto, la presente investigación tuvo como objetivo principal contribuir con la caracterización
metagenómica de la microbiota expuesta a agentes químicos y comprobar la sensibilidad y utilidad
probiótica contra vibrios parahaemolyticus en camarón blanco (Litopenaeus vannamei).
METODOLOGÍA
Recolección de las muestras de agua
El experimento se realizó en el laboratorio de producción de larvas de camarón TIBALLOSA en
Anconcito sector La Diablica, se recolecto muestras de agua de reservorio que tiene una capacidad de
400 toneladas la cual fue recolectada para la siembra de los nauplios de camarón, estas muestras de agua
fueron sometidos a tratamiento químico con ozono y fueron pasadas por bolsos filtrantes de 0,5 μm,
luego se mezclaron entre sí y se obtuvo una muestra patrón, posterior se colocó en un tubo falcón de 50
ml y se conservó la muestra 4°C hasta su respectivo análisis18.
Diseño del experimento
Para el estudio las muestras de agua de mar tratada con ozono fueron sembradas en agar Trypicasa soya
(TSA), agar Thiosulfato-Citrate-Bilis Sucrose (TCBS), agar Cetrimide; Chromagar Bacillus; Agar Man,
Rogosa y Sharpe (MRS). Se aislaron e identificaron los distintos morfotipos de las colonias en TSA al
2% de NaCl y se incubaron a 32°C por 48 horas para seleccionar la microbiota marina para otorgar un
periodo adicional destinado a la posible proliferación de nuevas colonias, ya que el tiempo podría ser
un factor crítico en el desarrollo bacteriano.
Se obtuvieron 2 consorcios bacterianos a los que se los denomino como RS3 y CN5 ambos fueron
puestos a crecer en medio de cultivo Trypticasa soya broth (TSB). Con el fin de determinar el efecto
probiótico de las cepas aisladas como son: CN5 y RS3 ambos aislados por triplicado se los sometió a
pág. 4121
pruebas de desafío por separado y una mezcla de ambas, se emplearon tres técnicas in vitro, (a) Técnica
de difusión con bacterias vivas, (b) difusión en agar, y (c) método de estría cruzada. Para todos los casos
de pruebas de desafío se utilizó la cepa viva de V. parahaemolyticus como agente patógeno y una colonia
oportunista invasiva (CINV) que se identificó a nivel de metagenómica de la región 16S rRNA con el
fin de identificar la especie correspondiente. igualmente, la mezcla de consorcios bacterianos.
Análisis de datos
Todos los análisis fueron realizados en el programa Minitab 19.0. Se analizó la normalidad de los datos
a través de un test de Anderson - Darling, luego se realizó un test de Levene (homocedasticidad).
Después, se trabajó con Anova de una vía y test a posteriori de Tukey con valor de significancia del 95
% de confiabilidad (p<0.05)
Evaluación de la actividad antagónica in vitro
Técnica de difusión con bacterias vivas o Inhibición simultánea
La preparación consistió en sembrar 100 ul de las bacterias patógenas crecidas en 30 ml de agar TSB al
2% con cloruro de sodio (NaCl), por 24 hrs luego se ajustó la concentración mediante un patrón de
turbidez aproximadamente a 0,5 de la escala de Mac Farland del V. parahaemolyticus a una
concentración de 1.7x106ufc/ml. con la ayuda de un hisopo de algodón esterilizado se distribuyó la
muestra por toda la superficie del agar, esto con el fin de obtener un crecimiento uniforme a manera de
césped de desarrollo bacteriano. Se dejó secar de 10 a 20 min en la cámara de flujo laminar. Finalmente,
de manera masiva con la ayuda de una micropipeta se colocaron de manera radial gotas con 30 ul
(microlitros) de las cepas antagónicas. Se dejó incubar durante 24 horas a 32°C. Las muestras se
trabajaron por triplicado19,20.
Técnica de difusión en agar.
Se sembró V. parahaemolyticus en medio TSA a una dosis de 1.7 x106 ufc/ml, posteriormente a cada
una de las placas se le hicieron 5 pocillos de 6mm de diámetro por 1mm de alto, sin que estos tocaran
por completo el fondo de la placa, pero igualmente se les selló el fondo con agar agar aproximadamente
10 ul en los cuales se vertieron 30 ul de las bacterias antagónicas. Finalmente, las placas se incubaron a
32°C por 24 horas20,25. Las muestras se trabajaron por triplicado.
pruebas de desafío por separado y una mezcla de ambas, se emplearon tres técnicas in vitro, (a) Técnica
de difusión con bacterias vivas, (b) difusión en agar, y (c) método de estría cruzada. Para todos los casos
de pruebas de desafío se utilizó la cepa viva de V. parahaemolyticus como agente patógeno y una colonia
oportunista invasiva (CINV) que se identificó a nivel de metagenómica de la región 16S rRNA con el
fin de identificar la especie correspondiente. igualmente, la mezcla de consorcios bacterianos.
Análisis de datos
Todos los análisis fueron realizados en el programa Minitab 19.0. Se analizó la normalidad de los datos
a través de un test de Anderson - Darling, luego se realizó un test de Levene (homocedasticidad).
Después, se trabajó con Anova de una vía y test a posteriori de Tukey con valor de significancia del 95
% de confiabilidad (p<0.05)
Evaluación de la actividad antagónica in vitro
Técnica de difusión con bacterias vivas o Inhibición simultánea
La preparación consistió en sembrar 100 ul de las bacterias patógenas crecidas en 30 ml de agar TSB al
2% con cloruro de sodio (NaCl), por 24 hrs luego se ajustó la concentración mediante un patrón de
turbidez aproximadamente a 0,5 de la escala de Mac Farland del V. parahaemolyticus a una
concentración de 1.7x106ufc/ml. con la ayuda de un hisopo de algodón esterilizado se distribuyó la
muestra por toda la superficie del agar, esto con el fin de obtener un crecimiento uniforme a manera de
césped de desarrollo bacteriano. Se dejó secar de 10 a 20 min en la cámara de flujo laminar. Finalmente,
de manera masiva con la ayuda de una micropipeta se colocaron de manera radial gotas con 30 ul
(microlitros) de las cepas antagónicas. Se dejó incubar durante 24 horas a 32°C. Las muestras se
trabajaron por triplicado19,20.
Técnica de difusión en agar.
Se sembró V. parahaemolyticus en medio TSA a una dosis de 1.7 x106 ufc/ml, posteriormente a cada
una de las placas se le hicieron 5 pocillos de 6mm de diámetro por 1mm de alto, sin que estos tocaran
por completo el fondo de la placa, pero igualmente se les selló el fondo con agar agar aproximadamente
10 ul en los cuales se vertieron 30 ul de las bacterias antagónicas. Finalmente, las placas se incubaron a
32°C por 24 horas20,25. Las muestras se trabajaron por triplicado.
pág. 4122
Método de estría cruzada.
Se realizó a partir de un cultivo líquido de TSB de 24 hrs en tubos de ensayo con (2% NaCl) donde
anteriormente se sembró posibles colonias probióticas (CN5; RS3) se tomó una muestra con un hisopo
estéril y se sembró una estría central o en forma de T con la cepa a evaluar y se incubó por 24 h a 32°C.
Del mismo modo se preparó una suspensión con la cepa patógena (V. parahaemolyticus) y se sembraron
por separado en un ángulo de 90° atravesando la zona de las bacterias candidatas cuando la estría
presentaba un buen crecimiento (3 a 5 mm de ancho). Posteriormente se observó la presencia o ausencia
de zona de inhibición a las 24-48 h de incubación y se realizaron mediciones21,22,28.
Identificación de las cepas con potencial antagónico por medio de biología molecular
Las cepas de bacterias de RS3 y CINV fueron enviadas a la empresa Biosecuence, para su secuenciación
de la región 16S rRNA e identificación de especie de todo el material genético, lo que permite identificar
las funciones y características de las bacterias individuales22.29.32.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis metagenómico de cepas aisladas muestra#1 (RS3)
La tabla 1 representa datos estadísticos expresados en porcentajes de lecturas que fueron identificadas y
clasificadas a nivel taxonómico de muestra 231212 AR-001-16S (RS3), donde el 99.08 % de géneros
no ha sido reconocido, siendo solo el 8.76 % clasificado a nivel de especie es decir de 13.945 pares de
bases de lecturas clasificadas a nivel taxonómico. (3)Nivel taxonómico Lecturas clasificadas a
nivel taxonómico.
% Total de lecturas
clasificadas a nivel
taxonómico
Reino 157,897 99,20
Filo 157,882 99,19
Clase 157,876 99,19
Orden 157,864 99,18
Familia 157,752 99,11
Género 157,702 99,08
Especie 13,945 8,76
Método de estría cruzada.
Se realizó a partir de un cultivo líquido de TSB de 24 hrs en tubos de ensayo con (2% NaCl) donde
anteriormente se sembró posibles colonias probióticas (CN5; RS3) se tomó una muestra con un hisopo
estéril y se sembró una estría central o en forma de T con la cepa a evaluar y se incubó por 24 h a 32°C.
Del mismo modo se preparó una suspensión con la cepa patógena (V. parahaemolyticus) y se sembraron
por separado en un ángulo de 90° atravesando la zona de las bacterias candidatas cuando la estría
presentaba un buen crecimiento (3 a 5 mm de ancho). Posteriormente se observó la presencia o ausencia
de zona de inhibición a las 24-48 h de incubación y se realizaron mediciones21,22,28.
Identificación de las cepas con potencial antagónico por medio de biología molecular
Las cepas de bacterias de RS3 y CINV fueron enviadas a la empresa Biosecuence, para su secuenciación
de la región 16S rRNA e identificación de especie de todo el material genético, lo que permite identificar
las funciones y características de las bacterias individuales22.29.32.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis metagenómico de cepas aisladas muestra#1 (RS3)
La tabla 1 representa datos estadísticos expresados en porcentajes de lecturas que fueron identificadas y
clasificadas a nivel taxonómico de muestra 231212 AR-001-16S (RS3), donde el 99.08 % de géneros
no ha sido reconocido, siendo solo el 8.76 % clasificado a nivel de especie es decir de 13.945 pares de
bases de lecturas clasificadas a nivel taxonómico. (3)Nivel taxonómico Lecturas clasificadas a
nivel taxonómico.
% Total de lecturas
clasificadas a nivel
taxonómico
Reino 157,897 99,20
Filo 157,882 99,19
Clase 157,876 99,19
Orden 157,864 99,18
Familia 157,752 99,11
Género 157,702 99,08
Especie 13,945 8,76
pág. 4123
Se identificaron 113 categorías taxonómicas totales a nivel de género, en la figura 1 se muestra los 8
principales resultados tales como un 87,64% pertenece a Bacillus_licheniformes, con 1.77%
Bacillus_aerius, 1,66% Vibrio_alginolyticus, 1,34% Bacillus_amyloliquefaciens, 0,90%
Bacillus_sonorensis, 0,75% Bacillus_carboniphilus, 0,66% Vibrio_ xuii, 0,62% Vibrio_ jasicida, 0,49%
Bacillus_vienamensis, 0,15% Bacillus_crescens 0,22% Bacillus_mojavensis y1.04% pertenece a otras
especies.
Según 42,43, en su estudio del sedimento de manglares mediante metagenómica, un 35% de las lecturas
no se pudo identificar a nivel de phylum. Esto sugiere que algunas bacterias presentes en la muestra
podrían no estar descritas previamente y, por lo tanto, no estar presentes en la base de datos de referencia
utilizada. En nuestro estudio, si bien la mayoría de las lecturas no se identificaron a nivel de género
(99.08%), la clasificación a nivel de phylum (24.38%) puede proporcionar información útil sobre la
composición general de la microbiota. Esto se debe a que el porcentaje de lecturas clasificadas aumenta
a medida que se asciende en el nivel taxonómico, siendo el phylum el nivel con mayor porcentaje de
lecturas clasificadas 51,52
Se identificaron 113 categorías taxonómicas totales a nivel de género, en la figura 1 se muestra los 8
principales resultados tales como un 87,64% pertenece a Bacillus_licheniformes, con 1.77%
Bacillus_aerius, 1,66% Vibrio_alginolyticus, 1,34% Bacillus_amyloliquefaciens, 0,90%
Bacillus_sonorensis, 0,75% Bacillus_carboniphilus, 0,66% Vibrio_ xuii, 0,62% Vibrio_ jasicida, 0,49%
Bacillus_vienamensis, 0,15% Bacillus_crescens 0,22% Bacillus_mojavensis y1.04% pertenece a otras
especies.
Según 42,43, en su estudio del sedimento de manglares mediante metagenómica, un 35% de las lecturas
no se pudo identificar a nivel de phylum. Esto sugiere que algunas bacterias presentes en la muestra
podrían no estar descritas previamente y, por lo tanto, no estar presentes en la base de datos de referencia
utilizada. En nuestro estudio, si bien la mayoría de las lecturas no se identificaron a nivel de género
(99.08%), la clasificación a nivel de phylum (24.38%) puede proporcionar información útil sobre la
composición general de la microbiota. Esto se debe a que el porcentaje de lecturas clasificadas aumenta
a medida que se asciende en el nivel taxonómico, siendo el phylum el nivel con mayor porcentaje de
lecturas clasificadas 51,52
pág. 4124
Análisis metagenómico de cepas aisladas muestra #2 (CINV).
La tabla 2 representa datos estadísticos expresados en porcentajes de lecturas que fueron identificadas y
clasificadas a nivel taxonómico de muestra 231212 AR-002-16S (CINV), donde el 99.34 % de géneros
no ha sido reconocido, siendo solo el 8.76 % clasificado a nivel de especie, es decir 45.140 pares de
bases de lecturas clasificadas a nivel taxonómico.
Resultados de clasificación a nivel de especie
Nivel taxonómico
Lecturas clasificadas a nivel
taxonómico.
% Total de lecturas
clasificadas a nivel
taxonómico
Reino 164,127 99,50
Filo 164,119 99,49
Clase 164,116 99,49
Orden 164,077 99,47
Familia 164,072 99,46
Género 163,865 99,34
Especie 45,140 27,36
Análisis metagenómico de cepas aisladas muestra #2 (CINV).
La tabla 2 representa datos estadísticos expresados en porcentajes de lecturas que fueron identificadas y
clasificadas a nivel taxonómico de muestra 231212 AR-002-16S (CINV), donde el 99.34 % de géneros
no ha sido reconocido, siendo solo el 8.76 % clasificado a nivel de especie, es decir 45.140 pares de
bases de lecturas clasificadas a nivel taxonómico.
Resultados de clasificación a nivel de especie
Nivel taxonómico
Lecturas clasificadas a nivel
taxonómico.
% Total de lecturas
clasificadas a nivel
taxonómico
Reino 164,127 99,50
Filo 164,119 99,49
Clase 164,116 99,49
Orden 164,077 99,47
Familia 164,072 99,46
Género 163,865 99,34
Especie 45,140 27,36
pág. 4125
Resultados de clasificación a nivel de especie
En la figura se presen las especies pertenecientes al reino: bacteria, división: proteobacteria, clase:
Gammaproteobacteria, orden: vibrionales, familia: vibrionaceae y género: vibrio en donde los resultados
arrojan que un 45,25% pertenece a Vibrio_alginolyticus, con 25,64% Vibrio_jasicida, 13,91%
Vibrio_xuii, 12,12% Vibrio_alginolyticus, 0,78% Vibrio_agarivorans, con 0,43% pertenece a otras
especias, 0,42% Vibrio_parahaemolyticus, 0,15% Vibrio_alfacsensis. Estos resultados estadísticos
corroboran la presencia de varias especies de Vibrios dentro del consorcio C. INV.
Un dato relevante en el estudio de16,46, utilizando NGS muestra que los grupos dominantes en camarón
se clasificaron en seis géneros de Proteobacteria (Vibrio, Photobacterium, Pseudomonas,
Sphingomonas, Novosphingobiumcommon y Undibacterium), dos géneros de Firmicutes (Fusibacter y
Lactobacillus) y un género de Bacteroidetes (Cloacibacterium).
Evaluación de la potencialidad de cepas probióticas identificadas mediante metagenómica capaces
de inhibir el crecimiento de Vibrio parahaemolyticus mediante la técnica de Kirby Bauer.
Se cuantifico el crecimiento bacteriano de los consorcios CN5, RS3 y mezcla de ambos cultivados en
medio líquido TSB. Se realizaron diluciones seriadas en base 10 seleccionando las diluciones 10-4 y 10-
5 y 10-6 de cada uno de los consorcios bacterianos y se los procedió a sembrar en agar TSA, chromagar
bacillus y MRS para posterior conteo a las 24 hrs
Resultados de clasificación a nivel de especie
En la figura se presen las especies pertenecientes al reino: bacteria, división: proteobacteria, clase:
Gammaproteobacteria, orden: vibrionales, familia: vibrionaceae y género: vibrio en donde los resultados
arrojan que un 45,25% pertenece a Vibrio_alginolyticus, con 25,64% Vibrio_jasicida, 13,91%
Vibrio_xuii, 12,12% Vibrio_alginolyticus, 0,78% Vibrio_agarivorans, con 0,43% pertenece a otras
especias, 0,42% Vibrio_parahaemolyticus, 0,15% Vibrio_alfacsensis. Estos resultados estadísticos
corroboran la presencia de varias especies de Vibrios dentro del consorcio C. INV.
Un dato relevante en el estudio de16,46, utilizando NGS muestra que los grupos dominantes en camarón
se clasificaron en seis géneros de Proteobacteria (Vibrio, Photobacterium, Pseudomonas,
Sphingomonas, Novosphingobiumcommon y Undibacterium), dos géneros de Firmicutes (Fusibacter y
Lactobacillus) y un género de Bacteroidetes (Cloacibacterium).
Evaluación de la potencialidad de cepas probióticas identificadas mediante metagenómica capaces
de inhibir el crecimiento de Vibrio parahaemolyticus mediante la técnica de Kirby Bauer.
Se cuantifico el crecimiento bacteriano de los consorcios CN5, RS3 y mezcla de ambos cultivados en
medio líquido TSB. Se realizaron diluciones seriadas en base 10 seleccionando las diluciones 10-4 y 10-
5 y 10-6 de cada uno de los consorcios bacterianos y se los procedió a sembrar en agar TSA, chromagar
bacillus y MRS para posterior conteo a las 24 hrs
pág. 4126
Evaluación de la actividad antagónica in vitro
Todas las cepas aisladas presentaron algún grado de capacidad competitiva, en la prueba de antagonismo
in vitro sobre una cepa patógena de Vibrio parahaemolyticus y colonia invasiva (CINV). La combinación
de aislados de cepas CN5 y RS3 mostraron una capacidad de inhibición significativamente superior pues
se observó una formación de halo de crecimiento mayor en la superficie del agar, mientras que las cepas
por separado presentaron halos de inhibición menores. Para la prueba de inhibición simultánea se
observó que el 100% de los casos ambas cepas crecieron, sugiriendo así un efecto sinérgico entre ellas.
DISCUSIÓN
Todas las cepas aisladas presentaron algún grado de capacidad competitiva, en la prueba de antagonismo
in vitro sobre una cepa patógena de Vibrio parahaemolyticus y colonia invasiva (CINV). La
combinación de aislados de cepas CN5 y RS3 mostraron una capacidad de inhibición significativamente
superior pues se observó una formación de halo de crecimiento mayor en la superficie del agar, mientras
Evaluación de la actividad antagónica in vitro
Todas las cepas aisladas presentaron algún grado de capacidad competitiva, en la prueba de antagonismo
in vitro sobre una cepa patógena de Vibrio parahaemolyticus y colonia invasiva (CINV). La combinación
de aislados de cepas CN5 y RS3 mostraron una capacidad de inhibición significativamente superior pues
se observó una formación de halo de crecimiento mayor en la superficie del agar, mientras que las cepas
por separado presentaron halos de inhibición menores. Para la prueba de inhibición simultánea se
observó que el 100% de los casos ambas cepas crecieron, sugiriendo así un efecto sinérgico entre ellas.
DISCUSIÓN
Todas las cepas aisladas presentaron algún grado de capacidad competitiva, en la prueba de antagonismo
in vitro sobre una cepa patógena de Vibrio parahaemolyticus y colonia invasiva (CINV). La
combinación de aislados de cepas CN5 y RS3 mostraron una capacidad de inhibición significativamente
superior pues se observó una formación de halo de crecimiento mayor en la superficie del agar, mientras
pág. 4127
que las cepas por separado presentaron halos de inhibición menores. Para la prueba de inhibición
simultánea se observó que el 100% de los casos ambas cepas crecieron, sugiriendo así un efecto
sinérgico entre ellas.
Pruebas de normalidad para cada uno de los consorcios bacterianos CN5 y RS3 por separado y
combinados contra Vibrio parahaemolyticus y CINV demostrando los valores de p > 0,05 con un 95%
de confiabilidad es decir no hay diferencia significativa entre tratamientos.
que las cepas por separado presentaron halos de inhibición menores. Para la prueba de inhibición
simultánea se observó que el 100% de los casos ambas cepas crecieron, sugiriendo así un efecto
sinérgico entre ellas.
Pruebas de normalidad para cada uno de los consorcios bacterianos CN5 y RS3 por separado y
combinados contra Vibrio parahaemolyticus y CINV demostrando los valores de p > 0,05 con un 95%
de confiabilidad es decir no hay diferencia significativa entre tratamientos.
pág. 4128
TÉCNICA DE DIFUSIÓN EN AGAR
Pruebas de normalidad para cada uno de los consorcios bacterianos CN5 y RS3 por separado y
combinados contra Vibrio parahaemolyticus y CINV demostrando los valores de p > 0,05 con un 95%
de confiabilidad es decir no hay diferencia significativa entre tratamientos. Sin embargo, el tratamiento
del consorcio CN5 contra INV es diferente47,48,49.
TÉCNICA DE DIFUSIÓN EN AGAR
Pruebas de normalidad para cada uno de los consorcios bacterianos CN5 y RS3 por separado y
combinados contra Vibrio parahaemolyticus y CINV demostrando los valores de p > 0,05 con un 95%
de confiabilidad es decir no hay diferencia significativa entre tratamientos. Sin embargo, el tratamiento
del consorcio CN5 contra INV es diferente47,48,49.
pág. 4129
CONCLUSIONES
Se logro aislar un conjunto de cepas bacterianas de agua de mar mediante cultivos in vitro con
características probióticas potenciales.
El análisis metagenómico reveló la diversidad genética de bacterias probióticas y sus posibles
interacciones con otros microorganismos, incluyendo Vibrio sp y proporciono información detallada de
la clasificación taxonómica, encontrando 113 categorías a nivel de género en RS3 y 85 categorías en
CINV.
Las categorías taxonómicas a nivel de especie de la muestra RS3, destacan 87,64% perteneciente a
Bacillus_licheniformes, con 1.77% Bacillus_aerius, 1,66% Vibrio_alginolyticus, 1,34%
Bacillus_amyloliquefaciens, 0,90% Bacillus_sonorensis, 0,75% Bacillus_carboniphilus, 0,66% Vibrio_
xuii, 0,62% Vibrio_ jasicida, 0,49% Bacillus_vienamensis, 0,15% Bacillus_crescens 0,22%
Bacillus_mojavensis y1.04% pertenece a otras especies.
Las categorías taxonómicas a nivel de especie de la muestra CINV, destacan 45,25% pertenece a
Vibrio_alginolyticus, con 25,64% Vibrio_jasicida, 13,91% Vibrio_xuii, 12,12%, Vibrio_alginolyticus,
0,78% Vibrio_agarivorans, con 0,43% pertenece a otras especias, 0,42% Vibrio_parahaemolyticus,
0,15% Vibrio_alfacsensis.
Mediante cultivos in vitro se demostró que todas las mezclas de cepas probióticas nativas mostraron una
alta potencialidad del 99% para inhibir el crecimiento de Vibrio sp y la bacteria denominada CINV. En
los estudios realizados mediante ANOVA no se encontró significancia entres los consorcios ya que
fueron valores superiores a 0,05. Los resultados sugieren que las cepas probióticas podrían ser utilizadas
para prevenir o controlar infecciones por Vibrio parahaemolyticus.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abasolo Pacheco, F. (2015). Selección y evaluación de bacterias del tracto digestivo del pectĺnido
mano de león (Nodipecten subnodosus) y de la concha nácar (Pteria sterna) con uso potencial
probiótico en la acuicultura de bivalvos marinos.
http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/469
CONCLUSIONES
Se logro aislar un conjunto de cepas bacterianas de agua de mar mediante cultivos in vitro con
características probióticas potenciales.
El análisis metagenómico reveló la diversidad genética de bacterias probióticas y sus posibles
interacciones con otros microorganismos, incluyendo Vibrio sp y proporciono información detallada de
la clasificación taxonómica, encontrando 113 categorías a nivel de género en RS3 y 85 categorías en
CINV.
Las categorías taxonómicas a nivel de especie de la muestra RS3, destacan 87,64% perteneciente a
Bacillus_licheniformes, con 1.77% Bacillus_aerius, 1,66% Vibrio_alginolyticus, 1,34%
Bacillus_amyloliquefaciens, 0,90% Bacillus_sonorensis, 0,75% Bacillus_carboniphilus, 0,66% Vibrio_
xuii, 0,62% Vibrio_ jasicida, 0,49% Bacillus_vienamensis, 0,15% Bacillus_crescens 0,22%
Bacillus_mojavensis y1.04% pertenece a otras especies.
Las categorías taxonómicas a nivel de especie de la muestra CINV, destacan 45,25% pertenece a
Vibrio_alginolyticus, con 25,64% Vibrio_jasicida, 13,91% Vibrio_xuii, 12,12%, Vibrio_alginolyticus,
0,78% Vibrio_agarivorans, con 0,43% pertenece a otras especias, 0,42% Vibrio_parahaemolyticus,
0,15% Vibrio_alfacsensis.
Mediante cultivos in vitro se demostró que todas las mezclas de cepas probióticas nativas mostraron una
alta potencialidad del 99% para inhibir el crecimiento de Vibrio sp y la bacteria denominada CINV. En
los estudios realizados mediante ANOVA no se encontró significancia entres los consorcios ya que
fueron valores superiores a 0,05. Los resultados sugieren que las cepas probióticas podrían ser utilizadas
para prevenir o controlar infecciones por Vibrio parahaemolyticus.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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probiótico en la acuicultura de bivalvos marinos.
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pág. 4130
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973.1999
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