IDENTIFICACIÓN DE LA REGIÓN MOLECULAR
DEL GEN 16S RIBOSOMAL DE LOS ICROORGANISMOS
LIGNOCELULÓSICOS OBTENIDOS DE LOS SUELOS
DE CAÑA DE AZUCAR DE LA EMPRESA
AGROINDUSTRIAL PARAMONGA S.A
MOLECULAR IDENTIFICATION OF THE 16S RRNA GENE REGION
IN LIGNOCELLULOLYTIC MICROORGANISMS ISOLATED FROM
SUGARCANE SOILS OF AGROINDUSTRIAL PARAMONGA S.A.
Heini Greace Romero Macedo
Universidad Nacional del Santa, Perú
José Mariano Melgar Belmo
Agro Industrial Paramonga S.A., Perú
Angelita Cabrera de Cipriano
Universidad Nacional de Trujillo, Perú
pág. 10357
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i3.18760
Identificación de la Región Molecular del Gen 16S Ribosomal de los
Microorganismos Lignocelulósicos Obtenidos de los Suelos de Caña de
Azucar de la Empresa Agroindustrial Paramonga S.A
Heini Greace Romero Macedo1
hromero@agroparamonga.com
https://orcid.org/0009-0003-0496-0682
Universidad Nacional del Santa
Perú
José Mariano Melgar Belmo
jmelgar@agroparamonga.com
Agro Industrial Paramonga S.A.
Perú
Angelita Cabrera de Cipriano
acabrera@unitru.edu.pe
https://orcid.org/0000-0003-3490-5011
Universidad Nacional de Trujillo
Perú
RESUMEN
Este trabajo aborda dos retos ambientales, cambio climático y degradación del suelo y propone
transformar residuos lignocelulósicos de caña de azúcar en carbono orgánico del suelo (COS) mediante
bacterias lignocelulolíticas. Se aislaron ocho cepas de suelos rizosféricos y se evaluó su capacidad de
degradar celulosa y lignina. En esta primera etapa, se identificó molecularmente la región del gen 16S
ribosomal para determinar con precisión las especies implicadas. Este análisis garantiza la ausencia de
fitotoxicidad y sienta las bases para desarrollar inoculantes microbianos que mitiguen emisiones de GEI
y mejoren la productividad de la caña bajo agricultura sostenible.
Palabras clave: residuos lignocelulósicos, bacterias lignocelulolíticas, caña de azúcar, carbono
orgánico
1
Autor principal
Correspondencia: hromero@agroparamonga.com
pág. 10358
Molecular Identification of the 16S rRNA Gene Region in Lignocellulolytic
Microorganisms Isolated from Sugarcane Soils of Agroindustrial
Paramonga S.A.
ABSTRACT
This study addresses two environmental challenges—climate change and soil degradation—and
proposes converting sugarcane lignocellulosic residues into soil organic carbon (SOC) using
lignocellulolytic bacteria. Eight strains were isolated from rhizospheric soils and their capacity to
degrade cellulose and lignin was evaluated. In this initial stage, the 16S ribosomal gene region was
molecularly identified to accurately determine the species involved. This analysis ensures the absence
of phytotoxicity and lays the groundwork for developing microbial inoculants that mitigate GHG
emissions and enhance sugarcane productivity under sustainable agriculture.
Keywords: residuos lignocelulósicos, bacterias lignocelulolíticas, caña de azúcar, carbono orgánico
Artículo recibido 15 mayo 2025
Aceptado para publicación: 18 junio 2025
pág. 10359
INTRODUCCIÓN
El cambio climático y la degradación de los suelos constituyen dos de los retos ambientales más
urgentes del siglo XXI, pues las prácticas agrícolas intensivas han reducido drásticamente el contenido
de carbono orgánico del suelo (COS), incrementando la mineralización de la materia orgánica,
liberando CO₂ y deteriorando la fertilidad edáfica (IPCC, 2003; Hernández et al., 2019). En este
contexto, el COS emerge como un componente clave no solo para el secuestro de carbono atmosférico,
sino también para mejorar la estructura del suelo, su capacidad de retención hídrica y la disponibilidad
de nutrientes, factores determinantes para la productividad de los cultivos (Paustian et al., 2016).
En Perú, la agroindustria azucarera genera diariamente cerca de 930 toneladas de residuos
lignocelulósicos cogollos y hojas secas de caña de azúcar que, de no gestionarse adecuadamente, se
convierten en fuentes de emisiones de gases de efecto invernadero y contribuyen a la pérdida de salud
del suelo (Ruiz, 2021; Vázquez et al., 2021). Ante este escenario, el uso de microorganismos
lignocelulolíticos que degradan simultáneamente lignina y celulosa se presenta como una estrategia
biotecnológica prometedora para transformar estos residuos en COS, acelerando la descomposición de
la biomasa y favoreciendo la incorporación de carbono al suelo, al tiempo que mejora la disponibilidad
de nutrientes para las plantas (Meng & Ragauskas, 2024).
No obstante, la mayoría de los estudios se han centrado en ensayos fenotípicos y enzimáticos —tales
como la formación de halos en agar CMC y lignina sin abordar de manera sistemática la caracterización
molecular de las cepas implicadas.
La secuenciación de la región del gen 16S ribosomal es reconocida como “reloj molecular” en
microbiología, pues permite identificar con alta precisión las especies bacterianas y evaluar sus
relaciones filogenéticas (Clarridge, 2004; Janda & Abbott, 2007). Aplicar esta herramienta al
aislamiento de bacterias lignocelulolíticas de suelos de caña de azúcar de la Empresa Agroindustrial
Paramonga S.A. llenaría un vacío importante en la literatura, al garantizar la selección de cepas no
fitotóxicas y funcionalmente relevantes para su uso como inoculantes.
Por ello, el objetivo general de este estudio es identificar molecularmente la región del gen 16S
ribosomal en bacterias lignocelulolíticas aisladas de suelos rizosféricos de caña de azúcar de Paramonga
S.A., con el fin de validar su seguridad y establecer una base científica sólida para el desarrollo de
pág. 10360
inoculantes microbianos que mitiguen emisiones de GEI y mejoren la productividad en sistemas de
agricultura sostenible.
METODOLOGÍA
En este estudio se siguió un diseño experimental que incluyó seis fases: recolección de muestras,
aislamiento y selección fenotípica de cepas lignocelulolíticas, purificación y conservación, extracción
de ADN, amplificación y secuenciación del gen 16S rRNA, y análisis bioinformático. Todas las pruebas
se realizaron por triplicado biológico y contaron con controles positivos (Streptomyces viridosporus) y
negativos (medios estériles sin inóculo).
Recolección de muestras
Se tomaron muestras de suelo rizosférico (0–15 cm) de tres parcelas de caña de azúcar de la Empresa
Agroindustrial Paramonga S.A. utilizando calicata y pala estériles. Cada muestra (300 g) se transportó
en bolsas estériles y se procesó en laboratorio en un plazo máximo de 24 h.
Aislamiento y selección fenotípica
Se preparó una suspensión de 10 g de suelo en 90 mL de tampón fosfato 0.1 M (pH 7.0) agitando a 200
rpm durante 30 min. A continuación, se inocularon alícuotas en placas con agar CMC (1 %
carboximetilcelulosa) y agar lignina (0.5 % lignina Kraft soluble), incubándose a 30 °C durante 72 h,
siguiendo los protocolos de Teather & Wood (1982) y Kirk & Farrell (1987). Posteriormente, la
actividad celulolítica se evaluó por tinción con rojo Congo (0.1 %) y lavado con NaCl 1 M, y la
ligninolítica, por decoloración con Lugol; a partir de las zonas de aclaramiento se midió el diámetro de
los halos con calibrador, seleccionándose las ocho cepas con los mayores promedios.
Purificación y conservación
Cada cepa seleccionada se purificó por resembrado sucesivo en agar nutritivo hasta obtener colonias
uniformes. Para su conservación, se prepararon suspensiones en glicerol al 15 % (v/v) y se almacenaron
a –80 °C.
Análisis molecular externo y bioinformático
Se remitieron al Laboratorio de Micología y Biotecnología del Centro de Extensionismo Tecnológico
de la Universidad Nacional Agraria La Molina (CET LMB UNALM) cultivos frescos de cada una de
las ocho cepas previamente sembradas en agar nutritivo, garantizando colonias en fase de crecimiento
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activo. En el laboratorio se extrajo el ADN genómico con kits comerciales validados para bacterias.
Posteriormente, se amplificó la región del gen 16S rRNA mediante PCR, y los amplicones resultantes
se confirmaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % teñido con DanaBlue. Finalmente, los
fragmentos amplificados fueron purificados y preparados para secuenciación Sanger bidireccional.
Seguidamente, se llevaron a cabo análisis bioinformáticos para confirmar la identidad taxonómica de
las cepas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación cualitativa de la actividad lignocelulolítica
Las cepas bacterianas fueron cultivadas en medios sólidos suplementados con carboximetilcelulosa
(CMC) y lignina para evaluar su capacidad hidrolítica. Esta se evidenció mediante la formación de halos
de aclaramiento en torno al crecimiento bacteriano. En la Imagen N°01, se observan los halos generados
por dos cepas representativas:
▪ La cepa B21, cultivada en agar CMC, generó un halo de hidrólisis con un diámetro de 3.2 cm,
indicando una actividad celulolítica destacada.
▪ La cepa B19, en agar lignina, mostró un halo bien definido de 3.0 cm de diámetro, lo que evidencia
una fuerte capacidad de degradación ligninolítica.
Figura 1
Formación de halos de hidrólisis en medios selectivos: (a) Cepa B21 en medio con CMC (tono amarillo
claro), (b) Cepa B19 en medio con lignina (tono rojizo), con halos claramente definidos.
pág. 10362
Resultados de la evaluación hidrolítica
Las cepas bacterianas obtenidas fueron evaluadas en medios sólidos selectivos con lignina y
carboximetilcelulosa (CMC) para determinar su capacidad de producir enzimas lignocelulolíticas. La
actividad hidrolítica se evidenció mediante la formación de halos de aclaramiento en torno a las
colonias. Las cepas que presentaron mayores diámetros de halo fueron seleccionadas para posteriores
análisis moleculares de identificación.
Tabla 1. Formación de halos de hidrólisis en medios con lignina y CMC de cepas bacterianas aisladas.
CEPA
AGAR LIGNINA (cm)
AGAR CMC (cm)
PGA01
2.1
2.2
PGA02
2.3
3.0
PGA03
1.5
2.1
PGA04
3.1
2.0
PGA05
1.8
2.5
PGA06
1.5
2.4
PGA07
1.5
2.7
PGA08
1.1
2.2
De acuerdo con los resultados obtenidos (Tabla 1), únicamente las cepas PGA01 a PGA08 mostraron
actividad enzimática detectable sobre sustratos ligninolíticos y celulolíticos, con halos de hidrólisis que
oscilaron entre 1.1 y 3.1 cm. En particular, la cepa PGA04 destacó por presentar el mayor halo en agar
con lignina (3.1 cm), mientras que PGA02 exhibió la mayor actividad sobre CMC (3.0 cm), lo cual
sugiere un elevado potencial lignocelulolítico.
Identificación molecular de cepas bacterianas mediante secuenciación del gen 16S rRNA
El análisis molecular confirmó la presencia de ocho cepas bacterianas con capacidades hidrolíticas
sobre lignina y celulosa.
Todas las cepas fueron aisladas de muestras de suelo rizosférico, lo que sugiere una estrecha relación
ecológica con la materia orgánica disponible en este ambiente agrícola.
pág. 10363
Tabla 2. Código y origen de las cepas bacterianas con actividad lignocelulolítica.
Código
PGA01
PGA02
PGA03
PGA04
PGA05
PGA06
PGA07
PGA08
Estas cepas destacaron por su capacidad de generar halos de hidrólisis en medios con lignina y
carboximetilcelulosa, lo que indica su potencial metabólico en la degradación de residuos agrícolas.
Los resultados de la identificación taxonómica específica (a nivel de género y especie) y su implicancia
funcional se detallan en la siguiente sección.
Análisis taxonómico y morfológico de las cepas bacterianas
Las ocho cepas seleccionadas por su capacidad hidrolítica fueron sometidas a análisis molecular
mediante secuenciación del gen 16S rRNA, permitiendo su identificación taxonómica hasta nivel de
especie. Este enfoque molecular, basado en la amplificación y comparación de secuencias conservadas,
ofrece una alta resolución filogenética, permitiendo además detectar microorganismos.
Los resultados se resumen en el Tabla 3., donde se presenta la jerarquía taxonómica completa de cada
cepa, desde filo hasta número de acceso en la base de datos NCBI:
Tabla 3. Clasificación taxonómica de las cepas bacterianas aisladas a partir de la secuenciación del gen
16S rRNA.
pág. 10364
Estas identificaciones confirman que la mayoría de las cepas pertenecen al filo Firmicutes, un grupo
conocido por su versatilidad metabólica y adaptabilidad en ambientes ricos en materia orgánica (Logan
et al., 2009). Se destacan especies de los géneros Bacillus, Exiguobacterium y Streptomyces,
ampliamente reportados en la literatura por su capacidad para producir enzimas lignocelulolíticas, tales
como celulasas, xilanasas y ligninasas (Ventorino et al., 2015; Berlemont & Martiny, 2013).
Tabla 4. Características macroscópicas y microscópicas de las cepas bacterianas
La diversidad en las características fenotípicas sugiere variabilidad metabólica entre los aislamientos,
lo cual es consistente con sus diferencias taxonómicas y actividades enzimáticas observadas
previamente. Destaca la prevalencia de bacterias Gram positivas con morfología bacilar, típica de
géneros como Bacillus y Exiguobacterium.
Observación morfológica en cultivo y microscopía
Las ocho cepas bacterianas seleccionadas fueron cultivadas en medio agar nutritivo para evaluar su
morfología macroscópica (colonias) y estructura celular mediante tinción de Gram, observadas a 100x
de aumento. Esta caracterización complementa los análisis moleculares y funcionales previos.
pág. 10365
Figura 2
Se muestran las colonias en medio agar nutritivo (izquierda de cada panel) y su respectiva observación
microscópica mediante tinción de Gram a 100x (derecha). Las imágenes evidencian variaciones en el
color, forma, textura de las colonias y en la morfología celular, lo cual respalda la diversidad fenotípica
entre las cepas aisladas.
El análisis mediante secuenciación del gen 16S ribosomal permitió identificar ocho cepas bacterianas
con características destacables como promotoras de crecimiento vegetal y degradadoras de biomasa
lignocelulósica. Todas las cepas mostraron ser rizobacterias beneficiosas, no tóxicas para el cultivo de
caña de azúcar ni para el equilibrio del suelo, lo que las convierte en candidatas ideales para aplicaciones
agrícolas sostenibles.
Entre las cepas identificadas, Bacillus halotolerans destacó por su capacidad para sintetizar
fitohormonas como el ácido indol-3-acético, esencial para el desarrollo radicular. Esta bacteria presenta
tres mecanismos clave de acción: producción de sideróforos que compiten por el hierro disponible,
solubilización de fosfatos minerales y biosíntesis de metabolitos promotores del crecimiento (Jiménez
pág. 10366
et al., 2020). Estas características la convierten en un valioso recurso para mejorar la productividad de
los cultivos.
Otra cepa relevante fue Bacillus licheniformis, bacteria Gram-positiva clasificada como GRAS
(Generally Recognized as Safe). Este microorganismo demostró una notable adaptabilidad a
condiciones ambientales extremas, soportando temperaturas entre 30-55°C y pH de 3 a 11, además de
tolerar altas concentraciones salinas (7-12%) (Ghani et al., 2013). Su capacidad para producir diversas
enzimas hidrolíticas, como α-amilasa, celulasa y pectinasa, amplía su potencial de aplicación tanto en
agricultura como en procesos industriales.
Los resultados obtenidos con Exiguobacterium acetylicum coinciden con estudios previos que reportan
su eficiencia en la degradación de componentes lignocelulósicos (Selvakumar et al. 2009) observaron
reducciones significativas en los contenidos de lignina (56.7%), hemicelulosa (39.6%) y celulosa
(37.5%) tras 10 días de tratamiento, superando notablemente los controles (Ali et al., 2017). Esta
capacidad, combinada con su potencial como promotor de crecimiento vegetal, posiciona a esta cepa
como candidata ideal para el desarrollo de biofertilizantes con doble función.
La identificación de Flavobacterium tagetis y diversas especies de Streptomyces sugiere importantes
sinergias potenciales. F. tagetis ha demostrado capacidad para degradar biomasa lignocelulolítica,
promover el crecimiento vegetal y participar en procesos de biorremediación (Cortez et al., 2017). Por
su parte, los Streptomyces spp., con su alta capacidad de recambio de materia orgánica y producción de
metabolitos secundarios beneficiosos, representan un valioso componente del microbiota del suelo
(Kawakami et al., 2014).
Estos hallazgos tienen relevantes aplicaciones prácticas para la agricultura sostenible, particularmente
en el cultivo de caña de azúcar. El desarrollo de inoculantes microbianos multiuso basados en estas
cepas podría permitir reducir el uso de insumos químicos, mejorar la estructura y fertilidad del suelo, y
aumentar la sostenibilidad del cultivo. Como perspectivas futuras, se recomienda realizar estudios de
compatibilidad entre cepas para formular consorcios efectivos, validar su eficacia en condiciones de
campo y optimizar los protocolos de aplicación. En conjunto, este estudio sienta una base sólida para
el desarrollo de biotecnologías innovadoras que transformen los residuos lignocelulósicos de la
agroindustria azucarera en recursos valiosos para el suelo y el clima.
pág. 10367
CONCLUSIONES
La identificación molecular de las 8 cepas bacterianas mediante el gen 16S ribosomal permitió su
correcta clasificación taxonómica y análisis filogenético. Estas cepas presentan características
metabólicas clave para la producción de enzimas hidrolíticas y adaptación a diferentes condiciones
ambientales.
El estudio confirmó su capacidad para formar consorcios microbianos eficientes en la degradación de
biomasa lignocelulósica, sin mostrar fitotoxicidad. Por el contrario, mejoran la microbiota rizosférica y
la disponibilidad de nutrientes.
Estos hallazgos confirman el potencial de las cepas como bioinoculantes agrícolas para cultivos de caña
de azúcar. Su uso puede representar una alternativa sostenible a los insumos agroquímicos
convencionales, contribuyendo tanto a la aumentar la productividad como a reducir el impacto
ambiental asociado a las prácticas agrícolas tradicionales.
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