POTENCIAL ANTIPARASITARIO DE
LA BICUCULINA EN TROFOZOÍTOS
DE GIARDIA LAMBLIA EN UN CULTIVO
IN VITRO
ANTIPARASITIC POTENTIAL OF BICUCULLINE AGAINST
GIARDIA LAMBLIA TROPHOZOITES IN VITRO CULTURE
Francisco Javier Munguía-Huizar
Universidad de Guadalajara, México
Araceli Castillo-Romero
Universidad de Guadalajara, México
Daniel Osmar Suárez-Rico
Universidad de Guadalajara, México
Armando Perez-Rangel
Instituto Politécnico Nacional, México
Jose Manuel Hernández-Hernández
Instituto Politécnico Nacional, México
pág. 11120
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i3.18878
Potencial Antiparasitario de la Bicuculina en Trofozoítos de Giardia
Lamblia en un Cultivo in Vitro
Francisco Javier Munguía-Huizar1
francisco.munguia.huizar@gmail.com
https://orcid.org/0009-0003-3402-6997
Departamento de Microbiología y Patología
Universidad de Guadalajara
Guadalajara, Jalisco, México
Araceli Castillo-Romero
araceli.castillo@academicos.udg.mx
https://orcid.org/0000-0002-4461-7673
Departamento de Microbiología y Patología
Universidad de Guadalajara
Guadalajara, Jalisco, México
Daniel Osmar Suárez-Rico
dosuarezr94@gmail.com
https://orcid.org/0000-0002-9237-213X
Departamento de Fisiología, Guadalajara
Jalisco, México
División de Medicina Molecular, Centro de
Investigación Biomédica de Occidente (CIBO),
Universidad de Guadalajara
Guadalajara, Jalisco, Mexico
Armando Perez-Rangel
rangelarm@yahoo.com
https://orcid.org/0009-0009-8573-9181
Departamento de Biología Celular
Centro de Investigación y Estudios Avanzados
del Instituto Politécnico Nacional
Ciudad de México, México
Jose Manuel Hernández-Hernández
manuel.hernandez@cinvestav.mx
https://orcid.org/0000-0001-9422-2437
Departamento de Biología Celular
Centro de Investigación y Estudios Avanzados
del Instituto Politécnico Nacional
Ciudad de México, México
RESUMEN
Giardia lamblia es un protozoo que causa giardiasis, una parasitosis prevalente a nivel mundial. El
tratamiento se ha complicado por la aparición de cepas resistentes y efectos secundarios, lo que ha
impulsado la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas. Recientemente, mediante ensayos in silico se
identificó al antagonista del receptor GABA-A bicuculina como candidato contra este parásito. Es por
ello que el objetivo de este estudio fue evaluar la actividad biológica de la bicuculina en trofozoítos de
G. lamblia de tal manera que en un futuro se pueda contar con nuevas alternativas de tratamiento contra
esta parasitosis. Trofozoítos de G. lamblia se crecieron en presencia de 0, 50, 100 y 200 µM de
bicuculina durante 24, 48 y 72 horas. Los resultados obtenidos demostraron que bicuculina inhibe el
crecimiento y la adhesión de los trofozoítos, lo que sugiere daño en el disco ventral. Por microscopia
de campo claro y fluorescencia se observaron alteraciones morfológicas y cambios en la distribución
de tubulina, especialmente en cuerpo medio, disco ventral y flagelos.
Palabras clave: giardia lamblia, bicuculina, reposicionamiento de fármacos, tubulina
1
Autor principal
2 Correspondencia principal: araceli.castillo@academicos.udg.mx.
pág. 11121
Antiparasitic Potential of Bicuculline Against Giardia Lamblia
Trophozoites in Vitro Culture
ABSTRACT
Giardia lamblia is a protozoan that causes giardiasis, a widespread parasitic disease. Treatment has
become increasingly challenging due to the emergence of resistant strains and adverse side effects,
driving the search for new therapeutic alternatives. Recently, in silico assays identified the GABA
receptor antagonist bicuculline as a potential candidate against this parasite. Therefore, the objective of
this study was to evaluate the biological activity of bicuculline on G. lamblia trophozoites, to contribute
to the development of new treatments for giardiasis. G. lamblia trophozoites were cultured in the
presence of 0, 50, 100, and 200 µM bicuculline for 24, 48, and 72 hours. The results indicated that
bicuculline inhibits trophozoite growth and adhesion, suggesting damage to the ventral disc. Bright-
field and fluorescence microscopy revealed morphological alterations and changes in tubulin
distribution, particularly in the median body, ventral disc, and flagella.
Keywords: giardia lamblia, bicuculin, drug repurposing, tubulin
Artículo recibido 09 junio 2025
Aceptado para publicación: 13 julio 2025
pág. 11122
INTRODUCCIÓN
La giardiasis es una parasitosis altamente infecciosa y difícil de erradicar producida por el protozoo
flagelado Giardia lamblia. En la mayoría de los casos cursa de manera asintomática, las infecciones
sintomáticas típicamente incluyen cólicos estomacales, distensión abdominal, náuseas y diarrea grasa
(Lalle & Hanevik, 2018; Leung et al., 2019). Si bien, la mayoría de los pacientes se recupera por
completo otros pueden experimentar síntomas persistentes o recurrentes, a corto y largo plazo, tales
como el síndrome del intestino irritable, malabsorción y deficiencias nutricionales, función cognitiva
deficiente, artritis reactiva asociada con una respuesta inmunológica exacerbada, entre otros (Halliez &
Buret, 2013; Painter et al., 2017). El tratamiento actual de la giardiasis involucra derivados del 5-
nitroimidazol, así como algunos benzimidazoles, todos ellos con perfiles de eficacia y efectos
secundarios variables, que pueden incluir desde malestias gastrointestinales hasta efectos neurotóxicos
y daño hepático (Chen et al., 2023; Hernández Ceruelos et al., 2019; Piloiu & Dumitrascu, 2021;
Vivancos et al., 2018; Watkins & Eckmann, 2014). Aunado a lo anterior, la resistencia adquirida y el
aumento en fallos terapéuticos han propiciado una demanda creciente de nuevos compuestos
antigiardiasicos (Ansell et al., 2015; Argüello-García et al., 2020; Leitsch, 2015). En este contexto, el
reposicionamiento de fármacos, que implica encontrar nuevos usos a medicamentos ya aprobados por
la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés Food and Drug
Administration), se perfila como un enfoque clave en el desarrollo de nuevos tratamientos. Este enfoque
ofrece la ventaja de contar con compuestos con perfiles de seguridad conocidos y resultados más
rápidos. Ejemplos recientes incluyen a la terfenadina; originalmente desarrollada para tratar alergias, y
el ácido acetilsalicílico; ampliamente utilizado para el manejo del dolor y la inflamación, que han
mostrado actividad contra los trofozoítos de Giardia, pero que aún no se usan en la clínica para tratar
esta enfermedad (Ochoa-Maganda et al., 2020; Suárez-Rico et al., 2023). Otro ejemplo es la auranofina,
un antirreumatico que si bien ha mostrado ser eficaz contra el cáncer y enfermedades infecciosas,
incluida la giardiasis, su mecanismo de acción sigue siendo investigado (Mertens et al., 2023; Tejman-
Yarden et al., 2013). Recientemente, Palomo-Ligas y colaboradores (2019), identificaron a la proteína
hipotética XP_001709490 de G. lamblia (disponible en GiardiaDB.org), como canal putativo de potasio
(GiK).
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Ensayos de acoplamiento molecular permitieron identificar 39 fármacos afines al dominio de poro de
GiK, entre éstos se encontró a bicuculina (Palomo-Ligas et al., 2019), la cual es conocida por su acción
antagonista sobre los receptores GABA (ácido gamma amino butírico); influye en el funcionamiento
de los canales de potasio, específicamente en canales de potasio activados por calcio de pequeña
conductancia (SK, por sus siglas en inglés “small conductance calcium-activated potassium channels”),
los cuales son responsables de la hiperpolarización después del potencial de acción en células excitables
(Johnston, 2013). En este trabajo evaluamos la actividad antigiardiasica de bicuculina en un cultivo
axenico in vitro, nuestros hallazgos muestran que este fármaco inhibe el crecimiento y la adhesión de
los trofozoítos, provoca daños morfológicos y cambios en la distribución de alfa tubulina.
METODOLOGÍA
Cultivo y mantenimiento
El cultivo y mantenimiento de los trofozoítos de G. lamblia (WB C6) se realizó a 37 °C en tubos de
borosilicato con medio de crecimiento (TYI-S-33 a pH 7.0), suplementado con suero fetal bovino al
10% (Gibco®, 16000-044) y antibiótico penicilina/estreptomicina al 1% (Sigma-Aldrich P4333)
(Keister, 1983). El cultivo se conservó realizando subcultivos dos veces por semana, incubando los
tubos en agua-hielo por 30 min para facilitar el desprendimiento de los trofozoítos, que luego se
transfirieron (0.5 x 105 trofozoítos/mL) a un tubo con medio nuevo y se incubaron a 37 °C para su
crecimiento. Todos los experimentos se realizaron utilizando cultivos en fase exponencial de
crecimiento (70-80% de confluencia). El recuento celular se realizó en cámara de Neubauer.
Determinación del efecto de bicuculina en el crecimiento trofozoítos de Giardia lamblia
▪ Ensayo de inhibición de crecimiento
Para evaluar el efecto de bicuculina en el crecimiento de G. lamblia, 10,000 trofozoítos/mL se crecieron
por 24, 48 y 72 h en presencia de 0, 50, 100 y 200 µM de bicuculina (Sigma-Aldrich, #14340). Como
control negativo se utilizó dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich, #D8418) al 0.2%, diluyente de
bicuculina y como control positivo se utilizó metronidazol (MTZ; 2 µM, Otrozol-PiSA), medicamento
de primera elección contra la giardiasis. Al término de cada tiempo, los trofozoítos se incubaron en
agua-hielo por 20 min, para despegar las células adheridas al tubo, y el número de trofozoítos se
determinó en cámara de Neubauer.
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Los resultados obtenidos se graficaron para comparar el crecimiento a cada tiempo y concentración de
fármaco. El porcentaje de inhibición en el crecimiento del parásito se calculó en relación con el control
negativo, el cual se definió como el 100% de crecimiento. Se realizaron 3 ensayos independientes, cada
ensayo se realizó por triplicado, los resultados obtenidos se presentan como el promedio la desviación
estándar. Los datos se analizaron utilizando ANOVA de dos vías (GraphPad Prism versión 6.01 para
Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA). Valores de P < 0.05 se consideraron
estadísticamente significativos.
▪ Ensayo de viabilidad
Para evaluar la viabilidad de los trofozoítos de G. lamblia después del tratamiento con bicuculina, se
utilizó el método de tinción por exclusión de azul de tripano. 10 µL de los cultivos se mezclaron con 10
µL del colorante azul de tripano al 0.4% (Gibco BRL #15250-061), se contaron 100 células, incluyendo
aquellas que no estaban teñidas. La viabilidad se expresó como el porcentaje de células viables en
relación con el total de células tratadas con el diluyente (DMSO 0.2%).
▪ Ensayo de adherencia
Para determinar el efecto de bicuculina sobre la capacidad de adhesión de los trofozoítos a las paredes
del tubo de borosilicato, se cultivaron 10,000 trofozoítos/mL en medio de crecimiento, conteniendo 100
y 200µM de bicuculina, por 24 y 48 h. Al término de cada período de incubación, se retiró el medio que
contenía a los trofozoítos que no se adhirieron a la superficie de los tubos. Los tubos se rellenaron con
solución amortiguadora de fosfatos (PBS) fría y se incubaron en baño de agua-hielo por 30 min. El
efecto sobre la adherencia se expresó como porcentaje de trofozoítos no adheridos en relación con el
número total de células, los resultados obtenidos se compararon con cultivos control tratados con
DMSO (0.2%). El conteo de las células se realizó en cámara de Neubauer.
▪ Microscopía de campo claro
Para identificar las posibles alteraciones morfológicas en los trofozoítos de G. lamblia por efecto de la
bicuculina, parásitos expuestos a DMSO, 0, 100 y 200 µM de bicuculina durante 48 h se colectaron por
centrifugación por 10 min a 2500 rpm y se permitió su adherencia en cubreobjetos previamente
recubiertos con polietilenimina al 0.1% a 37 °C durante 30 min, los parásitos adheridos se fijaron con
metanol a -20 °C por 10 min y se lavaron con agua por 1 min.
pág. 11125
El montaje de las células en portaobjetos se realizó utilizando Gelvatol como medio de montaje. Los
portaobjetos se mantuvieron a temperatura ambiente (TA) por 24 h y se conservaron a -20 °C hasta su
análisis. Las muestras se observaron en el microscopio Nikon eclipse TS2.
Efecto de bicuculina en la localización y expresión de la proteína tubulina en G. lamblia
▪ Inmunofluorescencia
Para determinar cambios en la localización del citoesqueleto de tubulina, muestras de trofozoítos
expuestos por 48 h a DMSO, 0, 100 y 200 μM de bicuculina se adhirieron a cubreobjetos previamente
tratados con polietilenimina al 0.1%, a 37 °C durante 30 min. Los parásitos adheridos se fijaron con
metanol a -20 °C por 10 min y se lavaron con PBS 1X. Posteriormente, se permeabilizaron con una
solución de Tritón X-100 al 0.05% y SDS al 0.05% en PBS 1X por 10 min, se lavaron 3 veces con PBS
1X y se incubaron por 1 h con albumina de suero bovino (ASB, SIGMA, #A7030) al 0.1% en PBS,
para evitar uniones inespecíficas del anticuerpo. Los cubreobjetos se lavaron y se incubaron por 1 h a
TA con el anticuerpo primario anti--tubulina hecho en ratón (1:500, Invitrogen, #13-8000),
seguidamente se lavaron 3 veces con PBS 1X y se incubaron por 1 h a TA con el anticuerpo secundario
IgG de ratón acoplado a FITC (1:150, Invitrogen, #31569). Finalmente, las preparaciones se lavaron 8
veces con PBS 1X con incubación de 10 min cada uno. El montaje se realizó con vecta-shield/DAPI
(Zymed, Life Technologies, invitrogen, #P36931), las muestras se analizaron en el microscopio Nikon
eclipse TS2, las imágenes se procesaron con el software NIS-Element (Nikon).
▪ Preparación de los extractos celulares
A partir de cultivos expuestos a 0, 100 y 200 µM de bicuculina y DMSO por 48 h se obtuvieron extractos
totales. Brevemente, previo enfriamiento de los cultivos, los parásitos se recolectaron por centrifugación
a 2500 rpm por 10 min a 4 °C, los botones celulares se resuspendieron en PBS 1X, suplementado con
inhibidores de proteasas (CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail, Roche #11836153001), ortovanadato
de sodio 1mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1mM. El rompimiento celular se realizó
mediante sonicación a 130 W y una frecuencia de 20 kHz, con un voltaje de 3.0 V. Se aplicaron 7 ciclos
de sonicación de 10 segundos cada uno, con un periodo de descanso de 10 segundos entre ciclos. Los
homogenizados se centrifugaron a 2500 rpm y 4 °C para eliminar restos celulares. Los sobrenadantes
se conservaron a -20 °C hasta su uso.
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La cuantificación de proteínas se realizó por ensayo de micro-Bradford (Quick Start Bradford 1x Dye
Reagent, Bio Rad, #5000205), las mediciones de absorbancia se realizaron a una longitud de onda de
595 nm.
▪ SDS-PAGE y Western blot
Primeramente, se determinó el efecto de la bicuculina en el patrón electroforético, para esto, los
extractos celulares (20 µg) se separaron en geles de SDS-poliacrilamida al 10%, en una cámara
electroforética Mini PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad). Las muestras se prepararon en condiciones
reductoras con el buffer 2x Laemmli Sample (Bio-Rad #161-0737) complementado con 2-
mercaptoetanol al 5 % y se calentaron a 100°C por 5 min. La separación electroforética de las proteínas
se realizó a un voltaje constante de 100 V por 2 h. posteriormente, las proteínas se visualizaron por
tinción con azul de coomassie y analizadas con el software Image Studio Digits versión 5.2. Para
determinar el efecto de bicuculina en la expresión de tubulina, las proteínas fueron transferidas a una
membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) a 350 mA durante 90 min. La membrana se incubó por
1 h a TA con buffer de bloqueo 1X (Pierce, #37575) en PBS complementado con Tween-20 al 0.05%
(PBS-T), para evitar uniones inespecíficas. Se realizó un lavado con PBS-T y se incubó por 2 h con el
anticuerpo primario anti--tubulina hecho en ratón (1:500, Invitrogen 13-8000). Posteriormente, se
realizaron 3 lavados con PBS-T y se incubó por 1 h con el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón
hecho en cabra, acoplado a la peroxidasa de rábano (1:20000, Pierce, Thermo Scientific #31437).
Finalmente, la unión antígeno-anticuerpo se detectó por quimioluminiscencia (Western ECL, Bio-Rad
#170-5060) y la señal se capturó empleando el sistema C-Digit. Para el análisis de la imagen se utilizó
el Software Image Studio Digits versión 5.2.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Bicuculina inhibe el crecimiento y la supervivencia de los trofozoítos de Giardia lamblia
El tratamiento de los trofozoítos de G. lamblia con 0, DMSO, 50, 100 y 200 µM de bicuculina muestra
una inhibición en el crecimiento dosis-dependiente desde las 24 h de iniciado el ensayo (Fig. 1A). Con
200µM de bicuculina se observa el efecto máximo a las 48 h (38% de inhibición) y una disminución de
éste a las 72h (22% de inhibición), en comparación con los controles negativos (Fig. 1B).
pág. 11127
El metronidazol, por otro lado, resulto ser más activo, con una inhibición del 90% y 80% a las 48 y 72h,
respectivamente. Las células sin tratamiento y tratadas con DMSO no mostraron diferencia significativa
en su crecimiento. Los resultados de viabilidad mostraron que las células tratadas con bicuculina que
sobreviven no se tiñen con azul tripano (dato no mostrado), lo que sugiere el mecanismo de acción de
la bicuculina no está relacionado con el daño a la membrana plasmática. En el caso de G. lamblia, la
función de los canales de potasio aún no se comprende completamente; sin embargo, se propone que
pudieran estar involucrados en procesos de homeostasis iónica y mantenimiento del potencial de
membrana (Palomo et al., 2019). Estudios previos en otros protozoarios, como Plasmodium falciparum,
han demostrado que bloqueadores de canales de potasio, como el metioduro de bicuculina (una sal
cuaternaria), pueden interferir en funciones esenciales del parásito, tales como la regulación osmótica
y la señalización celular, lo que eventualmente conduce a su muerte (Waller et al., 2008). Es posible
que un mecanismo similar esté implicado en la actividad antigiardiásica de bicuculina, se necesita más
investigación para confirmar lo anterior.
Figura 1. Efecto de antigiardiásico de bicuculina.
A) Trofozoítos cultivados en presencia de bicuculina, DMSO (0.2%) el diluyente de la droga y metronidazol
(MTZ) se usaron como control negativo y positivo, respectivamente. B) Porcentaje de crecimiento de G. lamblia
en respuesta al tratamiento con bicuculina en comparación con el control DMSO. Los datos corresponden al valor
medio ± la desviación estándar de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *p < 0.05, **p <
0.01, ****p < 0.0001.
Bicuculina afecta la capacidad de adhesión en trofozoítos de Giardia lamblia.
La adhesión de los trofozoítos a las paredes del intestino delgado es un paso fundamental para la
infección y multiplicación de G. lamblia. Este proceso es mediado principalmente por el disco ventral,
una estructura especializada que permite la interacción mecánica directa con los enterocitos del huésped
(Nosala et al., 2023; Hagen et al., 2023).
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En este estudio, se evaluó el efecto de la bicuculina sobre la capacidad de adhesión de los trofozoítos,
utilizando como modelo in vitro la adherencia a la superficie de tubos de borosilicato. Los resultados
mostraron que la bicuculina disminuyó significativamente la adhesión de los trofozoítos de manera
dependiente de la concentración. Con 200 μM de bicuculina, solo el 65 % de la población permanecía
adherida a las 48 h, y esta proporción se redujo ligeramente a un 60 % a las 72 h (Fig. 2). Este efecto
contrasta con el control tratado con DMSO donde la adherencia de los trofozoítos a las paredes del tubo
no se vio alterada, lo que indica que bicuculina afecta el mecanismo de adhesión de los trofozoítos lo
cual podría estar relacionado con alteración de la estructura del disco ventral. Estudios previos han
reportado que el disco ventral está formado por una matriz de microtúbulos asociados a otros complejos
proteicos y que alteraciones en las proteínas que conforman esta estructura pueden llevar a una pérdida
de adherencia de los trofozoítos. Estas alteraciones, como las ocasionadas por los benzimidazoles, que
conducen al desensamble del disco ventral, provoca una menor adhesión y, por ende, a una reducción
en la capacidad infecciosa del parásito (Mariante et al., 2005). Estos hallazgos respaldan la hipótesis de
que la bicuculina podría estar interfiriendo con la integridad o funcionalidad del disco ventral.
Figura 2. Porcentaje de inhibición de la adhesión de trofozoítos de Giardia lamblia por efecto de
bicuculina.
Los datos corresponden al valor medio ± la desviación estándar de tres experimentos independientes realizados por triplicado.
*p < 0.05, **<0.01, **** p < 0.0001.
Análisis de la morfología de los trofozoítos de G. lamblia por efecto de bicuculina.
El análisis de la morfología de los trofozoítos de G. lamblia expuestos a bicuculina es fundamental para
entender cómo este compuesto afecta la integridad estructural del parásito.
pág. 11129
El analisis por microscopia de campo claro mostró que los trofozoítos tratados con bicuculina
presentaron alteraciones morfológicas evidentes, mientras que los controles (sin tratar y tratados con
DMSO) mantuvieron su forma piriforme característica; se aprecian los flagelos, los nucleos, la zona
caudal y el disco ventral sin alteraciones (Fig. 3 A y B). En contraste, los trofozoítos tratados con 100
µM de bicuculina muestran alteraciones en la región anterior ventral; sitio donde se localiza el disco
ventral, además de alteraciones en la zona caudal, por una aparente perdida de rigidez (Fig. 3C). A 200
µM, se observa un mayor número de trofozoítos con daño en la zona caudal (Fig. 3D). Considerando
que el citoesqueleto de G. lamblia es fundamental para dar la forma y soporte y que esta conformado
principalmente por microtubulos altamente dinámicos y estables, estudios previos han reportado que
agentes desestabilizantes de los microtúbulos, provocan deformidades estructurales similares, afectando
la morfología de los trofozoítos (Hagen et al., 2019; Chatterji et al., 2011). Estos resultados sugieren
que la bicuculina afecta la estabilidad de los microtúbulos, comprometiendo la funcionalidad y
estructuras críticas del parásito.
Figura 3. Alteración de la morfología de trofozoítos de G. lamblia por efecto de bicuculina.
Microscopias de cultivos expuestos por 48 h a A) trofozoítos sin tratamiento; B) DMSO como control negativo; C) 100µM
de bicuculina; D) 200µM de bicuculina. d= disco ventral; f= flagelo; zn= zona caudal; n=núcleo. * señala la región anterior
con daño. → señala parásitos con daño en zona caudal.
pág. 11130
Bicuculina provoca cambios en la distribución y expresión de tubulina en trofozoítos de Giardia
lamblia.
Para analizar las posibles alteraciones en la distribución del citoesqueleto de tubulina por efecto de
bicuculina, cultivos tratados con bicuculina y DMSO durante 48 h fueron evaluados mediante
microscopía de fluorescencia utilizando el anticuerpo anti-α-tubulina-FITC. En los trofozoítos sin
tratamiento y los tratados con DMSO, las imágenes que se obtuvieron muestran a tubulina distribuida
en todo el cuerpo del parásito, con una señal más intensa en la zona del cuerpo medio y disco ventral
(Fig. 4 A y B). Los trofozoítos tratados con bicuculina presentan alteraciones en la distribución y tinción
de tubulina de manera dosis-dependiente. Con 100 µM de bicuculina, se observó a tubulina más
condensada y agrupada en algunos cúmulos en la zona del disco ventral, con disminución de la marca
en todo el cuerpo del párásito. (Fig. 4C). Con 200 µM, se observa a tubulina más condensada y
formando cumulos en la región de los cuerpos basales, parabasales y flagelos, la marca en el disco
ventral se observa difusa y desarreglada señalando un aparente ensanchamiento de esta estrcutura (Fig.
4 D). En las células eucariotas se ha demostrado la participación del citoesqueleto en la forma celular y
en la organización de las estructuras internas. En Giardia, la motilidad y adhesión son procesos
fundamentales para la patogenia del parásito y éstos están mediados por el citoesqueleto. Nuestros
hallazgos sugieren que las alteraciones en el citoesqueleto de tubulina y en el disco ventral, por
bicuculina, están relacionadas con la inhibición en la capacidad de adhesión de los trofozoítos. Además,
coinciden con los reportados por Gutiérrez y colaboradores (2017), quienes observaron una distribución
irregular de tubulina con formación de agregados tras el tratamiento con curcumina, sugiriendo una
despolarización o fragmentación de los microtúbulos (Gutierrez et al., 2017). Adicionalmente, estudios
previos han demostrado que fármacos desestabilizadores de microtúbulos afectan la integridad
estructural de G. lamblia. Por ejemplo, el nocodazol induce cambios morfológicos en la membrana,
disco ventral y flagelos, además de generar vesiculaciones en la superficie celular (Mariante et al.,
2005). De manera similar, el oryzalin provoca el enroscamiento de los flagelos, interrupción de la
división celular y pérdida de la morfología normal (Terra et al., 2010).
pág. 11131
Figura 4 Efecto de bicuculina en la inmunolocalización de tubulina mediante microscopia de
fluorescencia.
Cultivos expuestos por 48 h a A) Control sin tratamiento; B) DMSO; C) 100µM de bicuculina; D) 200µM de bicuculina. d =
disco ventral, m= cuerpo medio, n = núcleo. Barra=10µm.
Para determinar si los cambios en la distribución e intensidad de la marca de tubulina se debían a una
reducción en la expresión de la proteína, realizamos un ensayo de Western blot (Fig. 5A). El análisis
densitométrico semicuantitativo mostró una ligera disminución en la señal a concentraciones de 100 y
200 µM de bicuculina; sin embargo, esta reducción no fue estadísticamente significativa en
comparación con el control DMSO ni con el control sin tratamiento (Fig. 5B). Esto sugiere que el
mecanismo de acción antigiardiásico de la bicuculina no está mediado por una disminución en la
expresión de tubulina, sino más bien por la desestabilización de las estructuras microtubulares,
afectando la morfología y funcionalidad del parásito. Hacen falta más estudios para confirmar lo
anterior.
pág. 11132
Figura 5 Efecto de bicuculina en la expresión de tubulina.
A) Western blot de extractos celulares de cultivos expuestos por 48 horas a 0, DMSO, 100µM, 200µM de bicuculina. B)
Análisis densitométrico semicuantitativo de la intensidad de la banda mediante el software Image Studio Digits. MP:
Marcador de peso.
Bicuculina provoca cambios en el patrón de distribución de proteínas.
Profundizando en los efectos de la bicuculina sobre la expresión proteica en Giardia lamblia se
extrajeron proteínas totales de cultivos expuestos a DMSO y bicuculina durante 48 y se analizaron por
SDS-PAGE en condiciones reductoras. Tras la extracción y cuantificación de proteínas, estas fueron
separadas en geles de SDS-poliacrilamida para evaluar su perfil electroforético. La figura 6 muestra
que las proteínas solubles de G. lamblia consisten en una mezcla heterogénea con masas moleculares
en un rango de 15 a 200 kDa. Se identificaron bandas con pesos moleculares de 26, 37, 53, 73 y 77 kDa
(Fig. 6A flechas), que evidenciaron cambios aparentes en su expresión tras el tratamiento con bicuculina
(Fig. 6B). Estos cambios sugieren que la bicuculina podría estar afectando proteínas críticas en la
homeostasis celular o en la estructura del citoesqueleto. En el genoma de G. lamblia (disponible en
GiardiaDB.org) se han identificado una variedad de proteínas de G. lamblia con pesos moleculares
entre 30 y 73 kDa que participan en funciones estructurales, enzimáticas y de membrana, esenciales
para la biología y patogenicidad del parásito, sin embargo, se requieren estudios adicionales, como
espectrometría de masas, para confirmar la identidad de las proteínas afectadas por bicuculina.
pág. 11133
Figura 6 Efecto de bicuculina en el patrón electroforético de proteínas totales de trofozoítos de Giardia
lamblia.
20µg de proteínas totales de cultivos de trofozoítos expuestos a 0, DMSO, 100µM, 200 µM de bicuculina y MTZ fueron
separados por SDS-PAGE en condiciones reductoras. A) Expuestos por 48 h. B) Expuestos por 72 h. C) Análisis de la señal
obtenida de la banda de 73kDa mediante el software Image Studio Digits. MP: Marcador de peso.
CONCLUSIONES
Bicuculina muestra actividad antigiardiasica en cultivos in vitro de trofozoítos de G. lamblia; afecta la
capacidad de adhesión del trofozoíto vía desestabilización del citoesqueleto de tubulina, sin afectar la
expresión de la proteína. Se necesitan estudios adicionales para dilucidar el mecanismo citotóxico de
bicuculina y evaluar su efecto en modelos in vivo. Tambien, es necesario investigar si la acción de
bicuculina está ligada a la proteína GiK y proponer a esta última como una nueva diana farmacológica.
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