Aprendizaje
de la pandemia por SARS-CoV-2
�
Rub�n D. Dur�
Laboratorio
Curie SRL
Universidad
Cat�lica Nuestra Sra. de Asunci�n
Asunci�n-Paraguay
Sandra B. Gonz�lez
Laboratorio
Curie SRL
Asunci�n-Paraguay
Ruth N. Zarate
Laboratorio
Curie SRL
Asunci�n-Paraguay
Andrea L. Fern�ndez
Universidad
Cat�lica Nuestra Sra. de Asunci�n
Asunci�n-Paraguay
Yessica L. Garc�a
Universidad
Cat�lica Nuestra Sra. de Asunci�n
Asunci�n-Paraguay
Mar�a T. Mart�nez de Filartiga
Laboratorio
Curie SRL
Asunci�n-Paraguay
RESUMEN
�El primer paso para iniciar el an�lisis molecular de muestras biol�gicas es la extracci�n de los �cidos nucleicos. El m�todo de elecci�n m�s empleado es el de la cromatograf�a en columnas de s�lica debido al alto grado de pureza que se consigue, sumado a la rapidez/simplicidad de la t�cnica. Por otra parte, es un m�todo costoso que genera residuos pl�sticos por ser de un solo uso. Considerando esto, planteamos una estrategia para reutilizar las columnas proponiendo un m�todo de inactivaci�n de las columnas previamente utilizadas, y su activaci�n con el prop�sito de regenerar la matriz de s�lica; a este proceso lo denominamos regeneraci�n de columnas. Hemos conseguido demostrar que la reutilizaci�n de las columnas regeneradas es eficaz al no detectarse material amplificable por RT-qPCR tras usar como muestra agua eluida a trav�s de la misma.
El beneficio del m�todo desarrollado se resume
en la utilidad y ahorro que se le puede dar a los reactivos y
materiales fungibles de laboratorio para realizar tanto diagn�sticos cl�nicos
como para investigaci�n en pa�ses que se ven limitados en recursos y
adquisici�n de kits para diagn�stico.
Palabras clave: columnas de purificaci�n RNA regeneradas;
RT-qPCR;SARS-CoV-2; covid-19.
Reuse, an
act little worked in Molecular Biology. Acquisition of knowledge from the
SARS-CoV-2 pandemic
ABSTRACT
�The first step to start the
molecular analysis of biological samples is the extraction of nucleic acids.
The most widely used method of choice is silica column chromatography due to
the high degree of purity achieved, added to the speed/simplicity of the
technique. On the other hand, it is an expensive method that generates plastic
waste because it is single-use. Considering this, we present a strategy to
reuse the columns proposing a method of inactivation of the previously used
columns, and their activation with the purpose of regenerating the silica
matrix; we call this process column regeneration. We have managed to
demonstrate that the reuse of the regenerated columns is effective as no
material amplifiable by RT-qPCR is detected after using water eluted through it
as a sample.
The benefit of the developed method is summarized in
the usefulness and savings that can be given to reagents and consumable
laboratory materials to carry out both clinical diagnoses and for research in
countries that are limited in resources and acquisition of diagnostic kits.
Keywords: regenerated RNA-purification column, RT-qPCR, SARS-CoV-2, covid-19.
Art�culo
recibido:� 05 febrero 2022
Aceptado para
publicaci�n: 28 febrero 2022
Correspondencia: [email protected]
Conflictos de Inter�s: Ninguna que declarar
En los primeros meses del 2020 se ha declarado
pandemia debido a la aparici�n y r�pida propagaci�n del virus SARS-CoV-2
causante del COVID-19
Desde el inicio de la pandemia se han realizado
esfuerzos para desarrollar estrategias innovadoras de cribado, detecci�n y
diagn�sticos de casos COVID-19
La disponibilidad de kits de extracci�n de RNA se ha convertido en una seria limitaci�n para el diagn�stico debido a la escasez impulsada por la demanda mundial, con mayor impacto en pa�ses con menor poder adquisitivo, y esto es particularmente m�s complicado en un pa�s que carece de la infraestructura para producir localmente kits de extracci�n de �cidos nucleicos.
Adem�s del alto costo de los kits comerciales,
estos son limitados a un solo uso seg�n la recomendaci�n del fabricante. Por
otro lado, estos kits generan desechos pl�sticos que tienen un impacto negativo
para el ambiente. Teniendo en cuenta estos factores, varios grupos de trabajo
han planteado estrategias para el reciclado de estas columnas, proponiendo
protocolos que permitan eliminar remanentes de �cido nucleico en las membranas
de s�lica, de tal manera a poder ser reutilizada en un siguiente proceso de
extracci�n. Inclusive existen kits comerciales dise�ados para este fin, aunque
la relaci�n costo/beneficio para la utilizaci�n de �stos debe ser analizada
antes de optar por esta opci�n
Con el objetivo de proveer una alternativa de extracci�n de �cidos nucleicos adquiriendo solo el buffer de lisis comercial y reutilizando las columnas de s�lica, se evaluaron el uso de etanol absoluto como buffer de uni�n y etanol diluido como buffer de lavado y un protocolo de regeneraci�n de dichas columnas de s�lica para obtener RNA de alta calidad, con reactivos y equipos comunes de un laboratorio.
2.
MATERIALES
Y M�TODOS
A. Prueba de componentes de extracci�n del
RNA
Muestras
Fueron seleccionadas muestras de hisopados nasofar�ngeos
previamente testeados en el laboratorio Curie S.R.L con resultados positivos
para SARS-CoV-2 (sin considerar el valor del Ct). Para todas las evaluaciones
se utilizaron pool de estas muestras positivas.
Extracci�n de RNA
Se utilizaron dos kits comerciales para la evaluaci�n de
componentes alternativos para la extracci�n de RNA basados en columnas de
s�lica: Qiagen (QIAamp DSP Virus spin kit, ref: 61704) y GeneAll (Ribospin vRD
ref: 302-103). Se evaluaron los siguientes componentes: buffer de uni�n y
buffer de lavados.
Se sigui� el protocolo
de cada kit considerando el siguiente esquema:
Cinco extracciones por grupo ensayado.
|
Componentes |
||||||
|
Ensayos |
Buffer de lisis |
Buffer de uni�n |
Buffer de lavado |
Buffer de eluci�n |
N�mero de extracciones |
|
|
Grupo 1 |
Qiagen Buffer AL |
Etanol 100% |
W1 |
Agua DNase free |
5 |
|
|
W2 |
||||||
|
Grupo 2 |
Qiagen Buffer AL |
Etanol 100% |
Etanol 70 % |
Agua DNase free |
5 |
|
|
Grupo 3 |
Ribospin Buffer VL |
RB1 |
RBW |
Agua DNase free |
5 |
|
|
RNW |
||||||
|
Grupo 4 |
Ribospin Buffer VL |
Etanol 100% |
Etanol 70 % |
Agua DNase free |
5 |
|
En los grupos 1 y 3 se sigui� el protocolo establecido
por cada fabricante.
Para los grupos 2 y 4 se ensayaron los componentes
propuestos.
Amplificaciones por RT-qPCR
Las amplificaciones de PCR fueron realizadas en el equipo
Rotor-Gene Q de la marca Qiagen. El kit de detecci�n utilizado es de la marca
Seegene AllPlex SARS-CoV-2; basada en la amplificaci�n de secuencias de los
genes E (envelope), N (nucleocapside), RdRp (RNA dependent RNA polimerase) y S
(Spike), adem�s los elementos adicionados para la detecci�n de la secuencia del
gen RNAsa P humano utilizado como control end�geno. El programa utilizado fue
el siguiente: 50 �C por 20 minutos, 95 �C por 15 minutos, 40 ciclos de 95 �C
por 10 seg y 60 �C por 40 segundos. Con fines pr�cticos, los an�lisis de los
resultados fueron basados solo en las amplificaciones del gen N y del gen RNAsa
P humano. La l�nea umbral fue establecida al 10 % de la escala de la curva de
amplificaci�n en todos los casos.
B. Regeneraci�n de columnas
Elecci�n de muestras
Fueron seleccionadas muestras de hisopados nasofar�ngeos
previamente testeados en el Laboratorio Curie S.R.L con resultados positivos
para SARS-CoV-2. Para todas las evaluaciones se utilizaron pool de estas
muestras positivas, con valor de Ct inferior a 20. Esto con el fin de
obtener una alta concentraci�n de RNA que asegure la saturaci�n de
las columnas, de manera que, en los pasos posteriores la eliminaci�n de RNA en
las mismas sea verificable tras el tratamiento al que iban a ser
sometidas.
Extracci�n de RNA
Esta parte del estudio fue realizado �nicamente con el kit
Ribospin vRD, siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. Esto debido a
que era el kit que ten�amos disponible en ese momento. Un total de 20
extracciones fueron realizadas, a partir de un pool de muestras con las
caracter�sticas descritas previamente, siendo as� 20 las columnas a ser
tratadas.
Regeneraci�n de las columnas de s�lica previa
inactivaci�n del RNA residual del SARS -CoV-2 .
Protocolo de inactivaci�n de columnas
utilizadas:
a) Sumergir las columnas en
soluci�n de HCl al 2 M y sonicaci�n por 1 hora
b) Incubaci�n overnight
c) Enjuagar con agua
ultrapura esterilizada
d) Agregar las columnas a
tubos de colecci�n
e) Adicionar 500 uL de agua
ultra pura libre de DNasas y centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto para
eliminar restos de HCl. Repetir este paso 3 veces.
f) Adicionar 500 uL de
etanol absoluto a cada columna y centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto
g) Secar las columnas por
centrifugaci�n a m�xima velocidad por tres minutos.
Para evaluar la eficacia del protocolo en la inactivaci�n, se
coloc� un nuevo tubo de microcentr�fuga de 1,5 mL a la columna de s�lica
tratada, se adicion� 50 μL ddH2O libre de DNAsas a las columnas
e incub� por 1 minuto. Posteriormente fueron centrifugadas a 12.500 rpm por 1
minuto. El eluido obtenido se proces� RT-qPCR como si fuese una muestra.
Para la reutilizaci�n de las columnas de s�lica inactivadas, en
una nueva extracci�n de RNA, deben ser reactivadas. Para ello se agrega 500
μL de etanol puro, se centrifuga a 14.000 rpm por 1 minuto. Finalmente, se
descarta el eluido y se centrifuga por 3 minutos a 14.000 rpm.
Eficiencia de la extracci�n de RNA viral entre
columnas regeneradas y columnas nuevas.
Para
evaluar la eficiencia de la extracci�n de RNA viral a partir de columnas
regeneradas (CR), se realizaron extracciones de RNA por triplicado a partir del
pool de muestras positivas utilizando 3 columnas del grupo de CR y 3
columnas nuevas (CN). Los RNA extra�dos fueron sometidos a una corrida de
RT-qPCR espec�fica para SARS-CoV-2, por duplicado.
Al mismo tiempo, con el objetivo de verificar que la efectividad de las columnas no se ve afectada con un segundo
tratamiento de inactivaci�n, fueron escogidas otras 3 columnas regeneradas
(CR), para luego ser sometidas a un segundo proceso de inactivaci�n. Estas
columnas resultantes (CR2) fueron utilizadas para una nueva extracci�n de RNA
del pool de muestras. Para evaluar si hubo diferencias significativas
entre cada grupo, los valores de Ct fueron sometidos al test de Fisher.
Test de Inhibici�n
Los procedimientos de extracci�n de �cido
nucleico deben eliminar o reducir considerablemente la cantidad de sustancias
inhibidoras que pueden afectar la PCR futura. Para asegurar la extracci�n,
utilizando columnas regeneradas, hay que asegurarse de haber eliminado
completamente estos inhibidores. Para ello, se llev� a cabo el m�todo de �
La calidad del �cido nucleico (ausencia relativa
de inhibidores de PCR) puede demostrarse analizando dos r�plicas de PCR
utilizando cuatro puntos de una diluci�n en serie de cuatro veces (1:4, 1:16,
1:64 y 1:256) de cada r�plica de extracci�n de �cido nucleico (corridas de
inhibici�n) utilizando el sistema de referencia espec�fico del tax�n. El
extracto de �cido nucleico se lleva primero a un nivel correspondiente a la
concentraci�n de �cido nucleico m�s alta que se pretende utilizar en el m�todo
de PCR posterior, la llamada muestra "sin diluir" (concentraci�n de
�cido nucleico de trabajo). A partir de esta primera muestra se prepara una
serie de diluciones al cu�druple (de 1:4 al 1:256). Para evaluar la presencia
de inhibidores, los valores de Cq de las cuatro muestras diluidas en serie se
representan frente al logaritmo del factor de diluci�n y se calcula una
ecuaci�n mediante regresi�n lineal. El valor Cq de la muestra "sin
diluir" extrapolada de la regresi�n lineal se compara con el Cq medido a
partir de la misma muestra. Para aceptar como �ptimos los extractos de �cido
nucleico se deben cumplir tres condiciones: la pendiente de la l�nea de
regresi�n debe estar entre -3.6 y -3.1; el coeficiente de determinaci�n (R2)
debe ser igual o superior a 0.98; y la diferencia entre el Cq medido y el valor
de Cq extrapolado (ΔCq), inferior a 0.5.
C. Evaluaci�n en conjunto de
componentes alternativos de la extracci�n y columnas regeneradas
Selecci�n y diluci�n de una
muestra
Tomando como referencia el Ct del gen N, se procedi�
a la diluci�n seriada de una muestra con valor de Ct inicial de 15 hasta un
valor de 32 (cercano al l�mite de detecci�n). La diluci�n fue realizada desde
1x10-1 hasta 1x10-5 utilizando, como diluyente, el mismo
medio de transporte viral. Con este ensayo se ha evaluado la eficacia tanto de
las columnas regeneradas asi como tambi�n de la utilizaci�n de etanol absoluto
como agente de uni�n de membrana y etanol al 70% como buffer de lavado.
Para evaluar la eficacia en conjunto, tanto de
las columnas regeneradas, as� como tambi�n de la utilizaci�n de etanol absoluto
como agente de uni�n a la membrana y, etanol al 70 % como buffer de lavado.,Para
evaluar la eficacia en conjunto, tanto de las columnas regeneradas, as� como la
utilizaci�n de etanol absoluto como agente de uni�n a la membrana y etanol al
70 % como buffer de lavado, se procedi� a la preparaci�n de una muestra con
valor de Ct para el gen N cercano al l�mite de detecci�n (35) mediante la
diluci�n seriada de misma (Ct=16, gen N). Las diluciones fueron realizadas con
las siguientes proporciones: 1/10, 1/100, 1/100, utilizando el mismo medio de
transporte viral como diluyente.
Extracci�n de RNA
De la muestra dilu�da fueron realizadas 10
extracciones siguiendo el protocolo alternativo y utilizando 10 columnas
inactivadas y regeneradas. Como control positivo del proceso, se realiz� una
extracci�n con el kit Ribospin seg�n descrito por el fabricante utilizando
columnas nuevas. Como control negativo del proceso de inactivaci�n se utiliz�
el elu�do de una de las columnas tratadas.
3.
RESULTADOS Y DISCUSI�N
Parte A. Componentes de extracci�n de RNA ensayados
En las siguientes gr�ficas se presentan las
curvas de amplificaci�n para el gen N y gen RNAsa P con sus valores de Ct
promedio y desviaciones correspondientes para cada grupo ensayado. Como se
puede observar, las amplificaciones del gen N para los grupos 1, 2, 3 y 4
arrojaron valores de Ct promedio de 21.62 (σ = 0.5), 24.63 (σ =
0.49), 21.38 (σ = 0.19) y 22.01 (σ = 0.2) respectivamente. Las
amplificaciones del gen RNAsa P para el grupo 1, 2, 3 y 4 arrojaron un
valor de Ct promedio de 24.52 (σ = 0.19), 25.24 (σ = 0.49), 25.42
(σ = 0.19) y 26.17 (σ = 0.14) respectivamente.
En el gr�fico 5a. se representan las curvas de amplificaci�n, el
valor de Ct promedio y la desviaci�n est�ndar de la secuencia correspondiente
al gen N del RNA extra�do del pool de muestras con valores de Ct menor a
20, usando columnas de s�lica nuevas del kit de Ribospin. Comparando con el
gr�fico de amplificaci�n del elu�do de las columnas regeneradas, donde s�lo se
observa la amplificaci�n del control positivo del kit, 5b.
Parte B.
Eficiencia de extracci�n
de RNA viral entre columnas regeneradas y columnas nuevas.
Los gr�ficos 6 y 7 comparan las curvas para el
gen N y el gen RNAsa P, respectivamente, junto con los valores de Ct promedio
obtenidos para cada grupo ensayado. De acuerdo al test de Fisher, se pudo
observar diferencias significativas (p=0,05) entre los valores de Ct del grupo
CN (Ct prom: 18.10, σ = 0.46) comparando con los del grupo de CR (Ct prom:
18.01, σ = 0.18) y para CR2 (Ct prom: 17.89, σ = 0.07), no habiendo
diferencias significativas entre los grupos CR y CR2.
A pesar de esta diferencia significativa con el
estad�stico evaluado, la diferencia entre los Ct promedio de los tres grupos es
menor a 1 Ct, criterio utilizado en PCR, lo que permite decir que en realidad
no existe diferencia entre los grupos ensayados. La diferencia observada con el
estad�stico de Fisher puede atribuirse a la homogeneizaci�n de las condiciones
matriciales de las columnas (CR y CR2) al ser tratadas con el protocolo de
inactivaci�n respecto a una CN.
Los valores de los Ct de cada ensayo realizado se
reflejan en la tabla suplementaria 1.
Tabla suplementaria 1.
|
Columna1 |
Ct N
CR |
Ct
N CN |
Ct
N CR2 |
Ct
RdRp CR |
Ct
RdRp CN |
Ct
RdRp CR2 |
|
18.39 |
18.72 |
17.83 |
25.21 |
24.66 |
25.12 |
|
|
18.16 |
18.86 |
18.08 |
25.04 |
24.96 |
25.03 |
|
|
17.8 |
17.44 |
17.87 |
25.09 |
25.21 |
25.3 |
|
|
17.82 |
17.46 |
17.85 |
25.1 |
25.16 |
25.28 |
|
|
17.92 |
18.05 |
17.8 |
25.18 |
25.67 |
25.44 |
|
|
17.94 |
18.06 |
17.91 |
25.22 |
25.15 |
25.2 |
|
|
Ct
promedio |
18.01 |
18.10 |
17.89 |
25.14 |
25.14 |
25.23 |
|
σ |
0.18 |
0.46 |
0.07 |
0.06 |
0.22 |
0.11 |
Test de Inhibici�n
Siguiendo el m�todo de
Primeramente, se determinaron los valores del pool
de muestra extra�da en una columna nueva, para tomarlos como referencia. Como
se puede observar en el gr�fico 8, se obtuvo unos valores de pendiente de
-3,3834 as� como una R2 = 0,9982, eficiencia del 97,49% y la
diferencia entre el Ct te�rico con el obtenido en el ensayo es 0,432. Los
resultados obtenidos demuestran que todos los par�metros analizados se
encuentran dentro de los criterios de aceptaci�n.
En las CR, la pendiente fue de -3,4913, una R2
=0,9991, eficiencia del 93, 38% y la diferencia entre el Ct te�rico y el
obtenido fue de 0,257, �stos par�metros se encuentran dentro del rango de
aceptaci�n seg�n los criterios establecidos, por lo que se puede concluir que
las columnas no se ven afectadas en la eficiencia de la extracci�n ni el
proceso general de extracci�n.
La totalidad de las extracciones dieron valores
de Ct similares al control positivo, en un rango de 31 y 33. Se puede observar
la no amplificaci�n del control negativo, el cual correspond�a a la eluci�n de
una de las columnas luego del tratamiento de inactivaci�n.
Parte C.
Evaluaci�n
en conjunto de componentes alternativos de la extracci�n y columnas regeneradas
Como se puede observar en el gr�fico 9, todas las
extracciones de la muestra dilu�da amplificaron para el gen N en un rango de Ct
de 31 a 33.
DISCUSI�N
La r�pida propagaci�n del virus
y su alta tasa de transmisibilidad ha forzado a la comunidad cient�fica a nivel
mundial a buscar m�todos alternativos de tamizaje a modo de poder mantener
activo el servicio de diagn�stico y brindar atenci�n oportuna a los casos
positivos, sin descuidar la b�squeda activa de contactos asintom�ticos que
tambi�n son importantes focos de diseminaci�n del virus.
Entre las alternativas de
detecci�n propuestas est�n las variantes de los m�todos de inactivaci�n por
calor a diversas temperaturas
Los m�todos de extracci�n de
�cidos nucleicos basados en matriz de s�lice son considerados uno de los
m�todos m�s utilizados en biolog�a molecular por la alta pureza del material
obtenido. Si bien cada columna de extracci�n fabricada posee diferencias
t�cnicas, son comparables desde el punto de vista qu�mico (poseen el mismo
componente), por lo cual, el protocolo propuesto es el mismo para ambos kits
comerciales ensayados en nuestro trabajo.��
Incluso, considerando que la lisis celular era diferente en cada kit, en
ninguno de ellos este proceso fue modificado. Al comparar los valores promedio
de Ct obtenidos tanto para el gen N como para la RNAsa P de las muestras
extra�das con el kit de Ribospin y Qiagen, los valores no presentan diferencia
significativa. Al comparar los valores de Ct promedio obtenidos para estos
genes con los obtenidos con el m�todo propuesto, se observa una diferencia con
el kit de Qiagen para el gen N, no as� para el gen RNAsa P. La posible causa de
esta diferencia puede deberse al espesor de la columna de s�lica, que implica
mayor densidad de grupos ani�nicos en la misma, con lo cual no utilizar un
buffer de lavado que contenga sales caotr�picas conlleva a una disminuci�n en
la recuperaci�n de los �cidos nucleicos. En tanto que, comparando los
resultados obtenidos con el kit de Ribospin, estos no presentan diferencias
significativas. La elecci�n de uno u otro m�todo de extracci�n afectan poco la
calidad de RNA, cuando la finalidad de este es la utilizaci�n en pruebas de
detecci�n por RT-qPCR. No obstante, deber�a realizarse m�s pruebas como las
fluorom�tricas que permitan cuantificar el RNA y evaluar en paralelo la calidad
e integridad del mismo a fin de estimar su utilidad en otras aplicaciones.
En cuanto a la regeneraci�n de
columnas, el m�todo est� basado en la publicaci�n de Siddappa et al.
El resultado de las
comparaciones de las amplificaciones obtenidas a partir de muestras extra�das
con CR, CR2 y CN, permiten observar diferencia estad�sticamente significativa
entre las columnas nuevas y las reutilizadas. Sin embargo, teniendo en cuenta
los criterios utilizados en an�lisis de datos de qPCR (diferencia entre los Ct
promedio de los grupos es < 1 Ct y desviaci�n est�ndar < a 1), esto
permite decir que no existen diferencias entre los tres grupos evaluados
Los resultados obtenidos en la
evaluaci�n de ausencias de inhibidores demostraron que todos los par�metros
analizados se encuentran dentro del rango de aceptaci�n, por lo que se puede
decir que la eliminaci�n de inhibidores, utilizando columnas tratadas, es tan
eficiente que al aparecer proporciona cualidades similares a las columnas
nuevas.
El m�todo de extracci�n
desarrollado y propuesto en este estudio consiste en la utilizaci�n de columnas
regeneradas junto con el buffer de lisis del kit de Ribospin, alcohol absoluto
como buffer de uni�n y, alcohol al 70 % como buffer de lavado. Adem�s, con este
m�todo propuesto los resultados obtenidos respecto al kit comercial no variaron
al evaluar una muestra diluida cerca del l�mite de detecci�n.
Lo propuesto en nuestro trabajo
es un modelo simplificado y reproducible sobre todo en situaciones adversas
como fueron los meses cr�ticos del inicio de la pandemia. Al mismo tiempo,
somos conscientes de que se deben realizar ensayos a mayor escala para
comprobar la reproducibilidad de los resultados y sus posibles aplicaciones en
otras �reas de biolog�a molecular.
El beneficio del m�todo
desarrollado se resume en la utilidad y ahorro que se le puede dar a los
reactivos y materiales fungibles de laboratorio para realizar tanto
diagn�sticos cl�nicos como para investigaci�n en pa�ses que se ven limitados en
recursos y adquisici�n de kits para diagn�stico.
4.
CONSIDERACIONES
FINALES
No corresponde
5.� LISTA DE REFERENCIAS
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Biswal, J. K., Ranjan, R., Singh Dahiya1, S., Mallick, S., &
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