Aprendizaje
de la pandemia por SARS-CoV-2
Rubén D. Duré
Laboratorio
Curie SRL
Universidad
Católica Nuestra Sra. de Asunción
Asunción-Paraguay
Sandra B. González
Laboratorio
Curie SRL
Asunción-Paraguay
Ruth N. Zarate
Laboratorio
Curie SRL
Asunción-Paraguay
Andrea L. Fernández
Universidad
Católica Nuestra Sra. de Asunción
Asunción-Paraguay
Yessica L. García
Universidad
Católica Nuestra Sra. de Asunción
Asunción-Paraguay
María T. Martínez de Filartiga
Laboratorio
Curie SRL
Asunción-Paraguay
RESUMEN
El primer paso para iniciar el análisis molecular de muestras biológicas es la extracción de los ácidos nucleicos. El método de elección más empleado es el de la cromatografía en columnas de sílica debido al alto grado de pureza que se consigue, sumado a la rapidez/simplicidad de la técnica. Por otra parte, es un método costoso que genera residuos plásticos por ser de un solo uso. Considerando esto, planteamos una estrategia para reutilizar las columnas proponiendo un método de inactivación de las columnas previamente utilizadas, y su activación con el propósito de regenerar la matriz de sílica; a este proceso lo denominamos regeneración de columnas. Hemos conseguido demostrar que la reutilización de las columnas regeneradas es eficaz al no detectarse material amplificable por RT-qPCR tras usar como muestra agua eluida a través de la misma.
El beneficio del método desarrollado se resume
en la utilidad y ahorro que se le puede dar a los reactivos y
materiales fungibles de laboratorio para realizar tanto diagnósticos clínicos
como para investigación en países que se ven limitados en recursos y
adquisición de kits para diagnóstico.
Palabras clave: columnas de purificación RNA regeneradas;
RT-qPCR;SARS-CoV-2; covid-19.
Reuse, an
act little worked in Molecular Biology. Acquisition of knowledge from the
SARS-CoV-2 pandemic
ABSTRACT
The first step to start the
molecular analysis of biological samples is the extraction of nucleic acids.
The most widely used method of choice is silica column chromatography due to
the high degree of purity achieved, added to the speed/simplicity of the
technique. On the other hand, it is an expensive method that generates plastic
waste because it is single-use. Considering this, we present a strategy to
reuse the columns proposing a method of inactivation of the previously used
columns, and their activation with the purpose of regenerating the silica
matrix; we call this process column regeneration. We have managed to
demonstrate that the reuse of the regenerated columns is effective as no
material amplifiable by RT-qPCR is detected after using water eluted through it
as a sample.
The benefit of the developed method is summarized in
the usefulness and savings that can be given to reagents and consumable
laboratory materials to carry out both clinical diagnoses and for research in
countries that are limited in resources and acquisition of diagnostic kits.
Keywords: regenerated RNA-purification column, RT-qPCR, SARS-CoV-2, covid-19.
Artículo
recibido: 05 febrero 2022
Aceptado para
publicación: 28 febrero 2022
Correspondencia: rdario.dure@gmail.com
Conflictos de Interés: Ninguna que declarar
En los primeros meses del 2020 se ha declarado
pandemia debido a la aparición y rápida propagación del virus SARS-CoV-2
causante del COVID-19
Desde el inicio de la pandemia se han realizado
esfuerzos para desarrollar estrategias innovadoras de cribado, detección y
diagnósticos de casos COVID-19
La disponibilidad de kits de extracción de RNA se ha convertido en una seria limitación para el diagnóstico debido a la escasez impulsada por la demanda mundial, con mayor impacto en países con menor poder adquisitivo, y esto es particularmente más complicado en un país que carece de la infraestructura para producir localmente kits de extracción de ácidos nucleicos.
Además del alto costo de los kits comerciales,
estos son limitados a un solo uso según la recomendación del fabricante. Por
otro lado, estos kits generan desechos plásticos que tienen un impacto negativo
para el ambiente. Teniendo en cuenta estos factores, varios grupos de trabajo
han planteado estrategias para el reciclado de estas columnas, proponiendo
protocolos que permitan eliminar remanentes de ácido nucleico en las membranas
de sílica, de tal manera a poder ser reutilizada en un siguiente proceso de
extracción. Inclusive existen kits comerciales diseñados para este fin, aunque
la relación costo/beneficio para la utilización de éstos debe ser analizada
antes de optar por esta opción
Con el objetivo de proveer una alternativa de extracción de ácidos nucleicos adquiriendo solo el buffer de lisis comercial y reutilizando las columnas de sílica, se evaluaron el uso de etanol absoluto como buffer de unión y etanol diluido como buffer de lavado y un protocolo de regeneración de dichas columnas de sílica para obtener RNA de alta calidad, con reactivos y equipos comunes de un laboratorio.
2.
MATERIALES
Y MÉTODOS
A. Prueba de componentes de extracción del
RNA
Muestras
Fueron seleccionadas muestras de hisopados nasofaríngeos
previamente testeados en el laboratorio Curie S.R.L con resultados positivos
para SARS-CoV-2 (sin considerar el valor del Ct). Para todas las evaluaciones
se utilizaron pool de estas muestras positivas.
Extracción de RNA
Se utilizaron dos kits comerciales para la evaluación de
componentes alternativos para la extracción de RNA basados en columnas de
sílica: Qiagen (QIAamp DSP Virus spin kit, ref: 61704) y GeneAll (Ribospin vRD
ref: 302-103). Se evaluaron los siguientes componentes: buffer de unión y
buffer de lavados.
Se siguió el protocolo
de cada kit considerando el siguiente esquema:
Cinco extracciones por grupo ensayado.
|
Componentes |
||||||
|
Ensayos |
Buffer de lisis |
Buffer de unión |
Buffer de lavado |
Buffer de elución |
Número de extracciones |
|
|
Grupo 1 |
Qiagen Buffer AL |
Etanol 100% |
W1 |
Agua DNase free |
5 |
|
|
W2 |
||||||
|
Grupo 2 |
Qiagen Buffer AL |
Etanol 100% |
Etanol 70 % |
Agua DNase free |
5 |
|
|
Grupo 3 |
Ribospin Buffer VL |
RB1 |
RBW |
Agua DNase free |
5 |
|
|
RNW |
||||||
|
Grupo 4 |
Ribospin Buffer VL |
Etanol 100% |
Etanol 70 % |
Agua DNase free |
5 |
|
En los grupos 1 y 3 se siguió el protocolo establecido
por cada fabricante.
Para los grupos 2 y 4 se ensayaron los componentes
propuestos.
Amplificaciones por RT-qPCR
Las amplificaciones de PCR fueron realizadas en el equipo
Rotor-Gene Q de la marca Qiagen. El kit de detección utilizado es de la marca
Seegene AllPlex SARS-CoV-2; basada en la amplificación de secuencias de los
genes E (envelope), N (nucleocapside), RdRp (RNA dependent RNA polimerase) y S
(Spike), además los elementos adicionados para la detección de la secuencia del
gen RNAsa P humano utilizado como control endógeno. El programa utilizado fue
el siguiente: 50 °C por 20 minutos, 95 °C por 15 minutos, 40 ciclos de 95 °C
por 10 seg y 60 °C por 40 segundos. Con fines prácticos, los análisis de los
resultados fueron basados solo en las amplificaciones del gen N y del gen RNAsa
P humano. La línea umbral fue establecida al 10 % de la escala de la curva de
amplificación en todos los casos.
B. Regeneración de columnas
Elección de muestras
Fueron seleccionadas muestras de hisopados nasofaríngeos
previamente testeados en el Laboratorio Curie S.R.L con resultados positivos
para SARS-CoV-2. Para todas las evaluaciones se utilizaron pool de estas
muestras positivas, con valor de Ct inferior a 20. Esto con el fin de
obtener una alta concentración de RNA que asegure la saturación de
las columnas, de manera que, en los pasos posteriores la eliminación de RNA en
las mismas sea verificable tras el tratamiento al que iban a ser
sometidas.
Extracción de RNA
Esta parte del estudio fue realizado únicamente con el kit
Ribospin vRD, siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. Esto debido a
que era el kit que teníamos disponible en ese momento. Un total de 20
extracciones fueron realizadas, a partir de un pool de muestras con las
características descritas previamente, siendo así 20 las columnas a ser
tratadas.
Regeneración de las columnas de sílica previa
inactivación del RNA residual del SARS -CoV-2 .
Protocolo de inactivación de columnas
utilizadas:
a) Sumergir las columnas en
solución de HCl al 2 M y sonicación por 1 hora
b) Incubación overnight
c) Enjuagar con agua
ultrapura esterilizada
d) Agregar las columnas a
tubos de colección
e) Adicionar 500 uL de agua
ultra pura libre de DNasas y centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto para
eliminar restos de HCl. Repetir este paso 3 veces.
f) Adicionar 500 uL de
etanol absoluto a cada columna y centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto
g) Secar las columnas por
centrifugación a máxima velocidad por tres minutos.
Para evaluar la eficacia del protocolo en la inactivación, se
colocó un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a la columna de sílica
tratada, se adicionó 50 μL ddH2O libre de DNAsas a las columnas
e incubó por 1 minuto. Posteriormente fueron centrifugadas a 12.500 rpm por 1
minuto. El eluido obtenido se procesó RT-qPCR como si fuese una muestra.
Para la reutilización de las columnas de sílica inactivadas, en
una nueva extracción de RNA, deben ser reactivadas. Para ello se agrega 500
μL de etanol puro, se centrifuga a 14.000 rpm por 1 minuto. Finalmente, se
descarta el eluido y se centrifuga por 3 minutos a 14.000 rpm.
Eficiencia de la extracción de RNA viral entre
columnas regeneradas y columnas nuevas.
Para
evaluar la eficiencia de la extracción de RNA viral a partir de columnas
regeneradas (CR), se realizaron extracciones de RNA por triplicado a partir del
pool de muestras positivas utilizando 3 columnas del grupo de CR y 3
columnas nuevas (CN). Los RNA extraídos fueron sometidos a una corrida de
RT-qPCR específica para SARS-CoV-2, por duplicado.
Al mismo tiempo, con el objetivo de verificar que la efectividad de las columnas no se ve afectada con un segundo
tratamiento de inactivación, fueron escogidas otras 3 columnas regeneradas
(CR), para luego ser sometidas a un segundo proceso de inactivación. Estas
columnas resultantes (CR2) fueron utilizadas para una nueva extracción de RNA
del pool de muestras. Para evaluar si hubo diferencias significativas
entre cada grupo, los valores de Ct fueron sometidos al test de Fisher.
Test de Inhibición
Los procedimientos de extracción de ácido
nucleico deben eliminar o reducir considerablemente la cantidad de sustancias
inhibidoras que pueden afectar la PCR futura. Para asegurar la extracción,
utilizando columnas regeneradas, hay que asegurarse de haber eliminado
completamente estos inhibidores. Para ello, se llevó a cabo el método de
La calidad del ácido nucleico (ausencia relativa
de inhibidores de PCR) puede demostrarse analizando dos réplicas de PCR
utilizando cuatro puntos de una dilución en serie de cuatro veces (1:4, 1:16,
1:64 y 1:256) de cada réplica de extracción de ácido nucleico (corridas de
inhibición) utilizando el sistema de referencia específico del taxón. El
extracto de ácido nucleico se lleva primero a un nivel correspondiente a la
concentración de ácido nucleico más alta que se pretende utilizar en el método
de PCR posterior, la llamada muestra "sin diluir" (concentración de
ácido nucleico de trabajo). A partir de esta primera muestra se prepara una
serie de diluciones al cuádruple (de 1:4 al 1:256). Para evaluar la presencia
de inhibidores, los valores de Cq de las cuatro muestras diluidas en serie se
representan frente al logaritmo del factor de dilución y se calcula una
ecuación mediante regresión lineal. El valor Cq de la muestra "sin
diluir" extrapolada de la regresión lineal se compara con el Cq medido a
partir de la misma muestra. Para aceptar como óptimos los extractos de ácido
nucleico se deben cumplir tres condiciones: la pendiente de la línea de
regresión debe estar entre -3.6 y -3.1; el coeficiente de determinación (R2)
debe ser igual o superior a 0.98; y la diferencia entre el Cq medido y el valor
de Cq extrapolado (ΔCq), inferior a 0.5.
C. Evaluación en conjunto de
componentes alternativos de la extracción y columnas regeneradas
Selección y dilución de una
muestra
Tomando como referencia el Ct del gen N, se procedió
a la dilución seriada de una muestra con valor de Ct inicial de 15 hasta un
valor de 32 (cercano al límite de detección). La dilución fue realizada desde
1x10-1 hasta 1x10-5 utilizando, como diluyente, el mismo
medio de transporte viral. Con este ensayo se ha evaluado la eficacia tanto de
las columnas regeneradas asi como también de la utilización de etanol absoluto
como agente de unión de membrana y etanol al 70% como buffer de lavado.
Para evaluar la eficacia en conjunto, tanto de
las columnas regeneradas, así como también de la utilización de etanol absoluto
como agente de unión a la membrana y, etanol al 70 % como buffer de lavado.,Para
evaluar la eficacia en conjunto, tanto de las columnas regeneradas, así como la
utilización de etanol absoluto como agente de unión a la membrana y etanol al
70 % como buffer de lavado, se procedió a la preparación de una muestra con
valor de Ct para el gen N cercano al límite de detección (35) mediante la
dilución seriada de misma (Ct=16, gen N). Las diluciones fueron realizadas con
las siguientes proporciones: 1/10, 1/100, 1/100, utilizando el mismo medio de
transporte viral como diluyente.
Extracción de RNA
De la muestra diluída fueron realizadas 10
extracciones siguiendo el protocolo alternativo y utilizando 10 columnas
inactivadas y regeneradas. Como control positivo del proceso, se realizó una
extracción con el kit Ribospin según descrito por el fabricante utilizando
columnas nuevas. Como control negativo del proceso de inactivación se utilizó
el eluído de una de las columnas tratadas.
3.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Parte A. Componentes de extracción de RNA ensayados
En las siguientes gráficas se presentan las
curvas de amplificación para el gen N y gen RNAsa P con sus valores de Ct
promedio y desviaciones correspondientes para cada grupo ensayado. Como se
puede observar, las amplificaciones del gen N para los grupos 1, 2, 3 y 4
arrojaron valores de Ct promedio de 21.62 (σ = 0.5), 24.63 (σ =
0.49), 21.38 (σ = 0.19) y 22.01 (σ = 0.2) respectivamente. Las
amplificaciones del gen RNAsa P para el grupo 1, 2, 3 y 4 arrojaron un
valor de Ct promedio de 24.52 (σ = 0.19), 25.24 (σ = 0.49), 25.42
(σ = 0.19) y 26.17 (σ = 0.14) respectivamente.
En el gráfico 5a. se representan las curvas de amplificación, el
valor de Ct promedio y la desviación estándar de la secuencia correspondiente
al gen N del RNA extraído del pool de muestras con valores de Ct menor a
20, usando columnas de sílica nuevas del kit de Ribospin. Comparando con el
gráfico de amplificación del eluído de las columnas regeneradas, donde sólo se
observa la amplificación del control positivo del kit, 5b.
Parte B.
Eficiencia de extracción
de RNA viral entre columnas regeneradas y columnas nuevas.
Los gráficos 6 y 7 comparan las curvas para el
gen N y el gen RNAsa P, respectivamente, junto con los valores de Ct promedio
obtenidos para cada grupo ensayado. De acuerdo al test de Fisher, se pudo
observar diferencias significativas (p=0,05) entre los valores de Ct del grupo
CN (Ct prom: 18.10, σ = 0.46) comparando con los del grupo de CR (Ct prom:
18.01, σ = 0.18) y para CR2 (Ct prom: 17.89, σ = 0.07), no habiendo
diferencias significativas entre los grupos CR y CR2.
A pesar de esta diferencia significativa con el
estadístico evaluado, la diferencia entre los Ct promedio de los tres grupos es
menor a 1 Ct, criterio utilizado en PCR, lo que permite decir que en realidad
no existe diferencia entre los grupos ensayados. La diferencia observada con el
estadístico de Fisher puede atribuirse a la homogeneización de las condiciones
matriciales de las columnas (CR y CR2) al ser tratadas con el protocolo de
inactivación respecto a una CN.
Los valores de los Ct de cada ensayo realizado se
reflejan en la tabla suplementaria 1.
Tabla suplementaria 1.
|
Columna1 |
Ct N
CR |
Ct
N CN |
Ct
N CR2 |
Ct
RdRp CR |
Ct
RdRp CN |
Ct
RdRp CR2 |
|
18.39 |
18.72 |
17.83 |
25.21 |
24.66 |
25.12 |
|
|
18.16 |
18.86 |
18.08 |
25.04 |
24.96 |
25.03 |
|
|
17.8 |
17.44 |
17.87 |
25.09 |
25.21 |
25.3 |
|
|
17.82 |
17.46 |
17.85 |
25.1 |
25.16 |
25.28 |
|
|
17.92 |
18.05 |
17.8 |
25.18 |
25.67 |
25.44 |
|
|
17.94 |
18.06 |
17.91 |
25.22 |
25.15 |
25.2 |
|
|
Ct
promedio |
18.01 |
18.10 |
17.89 |
25.14 |
25.14 |
25.23 |
|
σ |
0.18 |
0.46 |
0.07 |
0.06 |
0.22 |
0.11 |
Test de Inhibición
Siguiendo el método de
Primeramente, se determinaron los valores del pool
de muestra extraída en una columna nueva, para tomarlos como referencia. Como
se puede observar en el gráfico 8, se obtuvo unos valores de pendiente de
-3,3834 así como una R2 = 0,9982, eficiencia del 97,49% y la
diferencia entre el Ct teórico con el obtenido en el ensayo es 0,432. Los
resultados obtenidos demuestran que todos los parámetros analizados se
encuentran dentro de los criterios de aceptación.
En las CR, la pendiente fue de -3,4913, una R2
=0,9991, eficiencia del 93, 38% y la diferencia entre el Ct teórico y el
obtenido fue de 0,257, éstos parámetros se encuentran dentro del rango de
aceptación según los criterios establecidos, por lo que se puede concluir que
las columnas no se ven afectadas en la eficiencia de la extracción ni el
proceso general de extracción.
La totalidad de las extracciones dieron valores
de Ct similares al control positivo, en un rango de 31 y 33. Se puede observar
la no amplificación del control negativo, el cual correspondía a la elución de
una de las columnas luego del tratamiento de inactivación.
Parte C.
Evaluación
en conjunto de componentes alternativos de la extracción y columnas regeneradas
Como se puede observar en el gráfico 9, todas las
extracciones de la muestra diluída amplificaron para el gen N en un rango de Ct
de 31 a 33.
DISCUSIÓN
La rápida propagación del virus
y su alta tasa de transmisibilidad ha forzado a la comunidad científica a nivel
mundial a buscar métodos alternativos de tamizaje a modo de poder mantener
activo el servicio de diagnóstico y brindar atención oportuna a los casos
positivos, sin descuidar la búsqueda activa de contactos asintomáticos que
también son importantes focos de diseminación del virus.
Entre las alternativas de
detección propuestas están las variantes de los métodos de inactivación por
calor a diversas temperaturas
Los métodos de extracción de
ácidos nucleicos basados en matriz de sílice son considerados uno de los
métodos más utilizados en biología molecular por la alta pureza del material
obtenido. Si bien cada columna de extracción fabricada posee diferencias
técnicas, son comparables desde el punto de vista químico (poseen el mismo
componente), por lo cual, el protocolo propuesto es el mismo para ambos kits
comerciales ensayados en nuestro trabajo.
Incluso, considerando que la lisis celular era diferente en cada kit, en
ninguno de ellos este proceso fue modificado. Al comparar los valores promedio
de Ct obtenidos tanto para el gen N como para la RNAsa P de las muestras
extraídas con el kit de Ribospin y Qiagen, los valores no presentan diferencia
significativa. Al comparar los valores de Ct promedio obtenidos para estos
genes con los obtenidos con el método propuesto, se observa una diferencia con
el kit de Qiagen para el gen N, no así para el gen RNAsa P. La posible causa de
esta diferencia puede deberse al espesor de la columna de sílica, que implica
mayor densidad de grupos aniónicos en la misma, con lo cual no utilizar un
buffer de lavado que contenga sales caotrópicas conlleva a una disminución en
la recuperación de los ácidos nucleicos. En tanto que, comparando los
resultados obtenidos con el kit de Ribospin, estos no presentan diferencias
significativas. La elección de uno u otro método de extracción afectan poco la
calidad de RNA, cuando la finalidad de este es la utilización en pruebas de
detección por RT-qPCR. No obstante, debería realizarse más pruebas como las
fluorométricas que permitan cuantificar el RNA y evaluar en paralelo la calidad
e integridad del mismo a fin de estimar su utilidad en otras aplicaciones.
En cuanto a la regeneración de
columnas, el método está basado en la publicación de Siddappa et al.
El resultado de las
comparaciones de las amplificaciones obtenidas a partir de muestras extraídas
con CR, CR2 y CN, permiten observar diferencia estadísticamente significativa
entre las columnas nuevas y las reutilizadas. Sin embargo, teniendo en cuenta
los criterios utilizados en análisis de datos de qPCR (diferencia entre los Ct
promedio de los grupos es < 1 Ct y desviación estándar < a 1), esto
permite decir que no existen diferencias entre los tres grupos evaluados
Los resultados obtenidos en la
evaluación de ausencias de inhibidores demostraron que todos los parámetros
analizados se encuentran dentro del rango de aceptación, por lo que se puede
decir que la eliminación de inhibidores, utilizando columnas tratadas, es tan
eficiente que al aparecer proporciona cualidades similares a las columnas
nuevas.
El método de extracción
desarrollado y propuesto en este estudio consiste en la utilización de columnas
regeneradas junto con el buffer de lisis del kit de Ribospin, alcohol absoluto
como buffer de unión y, alcohol al 70 % como buffer de lavado. Además, con este
método propuesto los resultados obtenidos respecto al kit comercial no variaron
al evaluar una muestra diluida cerca del límite de detección.
Lo propuesto en nuestro trabajo
es un modelo simplificado y reproducible sobre todo en situaciones adversas
como fueron los meses críticos del inicio de la pandemia. Al mismo tiempo,
somos conscientes de que se deben realizar ensayos a mayor escala para
comprobar la reproducibilidad de los resultados y sus posibles aplicaciones en
otras áreas de biología molecular.
El beneficio del método
desarrollado se resume en la utilidad y ahorro que se le puede dar a los
reactivos y materiales fungibles de laboratorio para realizar tanto
diagnósticos clínicos como para investigación en países que se ven limitados en
recursos y adquisición de kits para diagnóstico.
4.
CONSIDERACIONES
FINALES
No corresponde
5. LISTA DE REFERENCIAS
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