pág. 40
DISTANCIAS GENÉTICAS DE PLÁSMIDOS DE
VIBRIO SPP AISLADAS DE LANGOSTINOS DE
VIDA LIBRE AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD
AGUDA DE LA NECROSIS DEL
HEPATOPÁNCREAS, TUMBES, PERÚ
GENETIC DISTANCES OF VIBRIO SPP PLASMIDS ISOLATED FROM
FREE-LIVING SHRIMPS AFECTED BY ACUTE HEPATOPÁNCREAS
NECROSIS DISEASE, TUMBES, PERU
María Elena Rodrigo-Rojas
Laboratorio de Investigación en Biología, Universidad Nacional Federico Villarreal Lima, Perú.
Rodolfo Zenaido Velazco-Peña
Laboratorio de Sanidad Acuícola del Callao –SANIPES Lima, Perú.
Fredy Virgilio Salinas-Meléndez
Laboratorio de Investigación en Biología, Universidad Nacional Federico Villarreal Lima, Perú.
Ramsés Salas-Asencios
Grupo de Investigación Bienestar y Salud Global Lima, Escuela Universitaria de Posgrado,
UNFV,
pág. 41
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i4.19588
Distancias genéticas de plásmidos de Vibrio spp aisladas de langostinos de
vida libre afectados con la enfermedad aguda de la necrosis del
hepatopáncreas, Tumbes, Perú
María Elena Rodrigo-Rojas1
rsalas@unfv.edu.pe
https://orcid.org/0000-0002-1555-4036
Laboratorio de Investigación en Biología,
Universidad Nacional Federico Villarreal Lima,
Perú.
Rodolfo Zenaido Velazco-Peña
https://orcid.org/0000-0002-2578-8493
Laboratorio de Sanidad Acuícola del Callao –
SANIPES Lima, Perú.
Fredy Virgilio Salinas-Meléndez
https://orcid.org/0000-0003-0463-3174
Laboratorio de Investigación en Biotecnología,
Universidad Nacional Federico Villarreal Lima,
Perú
Ramsés Salas-Asencios
https://orcid.org/0000-0002-4075-1736
Grupo de Investigación Bienestar y Salud
Global Lima, Escuela Universitaria de Posgrado,
UNFV,
Lima, Perú.
RESUMEN
Se aislaron cepas de Vibrio spp. positivas para la toxina PirA-B a partir de langostinos de vida libre
provenientes de los estuarios de Tumbes, afectados por la enfermedad aguda de la necrosis del
hepatopáncreas (AHPND). De estas cepas, se aislaron cuatro plásmidos conteniendo el gen PirA-B, y
se obtuvieron las secuencias nucleotídicas de los mismos. Se realizó un análisis de similitud de dichas
secuencias con 7 secuencias de plásmidos similares reportadas en GenBank, con las cuales se realizó un
análisis de alineamiento múltiple y cálculo de distancias genéticas. Los resultados muestran que tres de
los plásmidos aislados presentan un tamaño promedio de 75.29 kb, y un plásmido presentaba un tamaño
menor (37.71 kb). Todos los plásmidos aislados presentaron secuencias nucleotídicas muy similares
entre sí y tres presentaban una gran similitud de secuencia con una de las obtenidas de GenBank, con
código de acceso CP097860 proveniente de China. Sólo un plásmido de Tumbes presentó mayor
divergencia con esta secuencia de referencia.
Palabras clave: AHPND, plásmidos, Vibrio, distancias genéticas
1 Autor principal
Correspondencia: rsalas@unfv.edu.pe
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i4.19588
Distancias genéticas de plásmidos de Vibrio spp aisladas de langostinos de
vida libre afectados con la enfermedad aguda de la necrosis del
hepatopáncreas, Tumbes, Perú
María Elena Rodrigo-Rojas1
rsalas@unfv.edu.pe
https://orcid.org/0000-0002-1555-4036
Laboratorio de Investigación en Biología,
Universidad Nacional Federico Villarreal Lima,
Perú.
Rodolfo Zenaido Velazco-Peña
https://orcid.org/0000-0002-2578-8493
Laboratorio de Sanidad Acuícola del Callao –
SANIPES Lima, Perú.
Fredy Virgilio Salinas-Meléndez
https://orcid.org/0000-0003-0463-3174
Laboratorio de Investigación en Biotecnología,
Universidad Nacional Federico Villarreal Lima,
Perú
Ramsés Salas-Asencios
https://orcid.org/0000-0002-4075-1736
Grupo de Investigación Bienestar y Salud
Global Lima, Escuela Universitaria de Posgrado,
UNFV,
Lima, Perú.
RESUMEN
Se aislaron cepas de Vibrio spp. positivas para la toxina PirA-B a partir de langostinos de vida libre
provenientes de los estuarios de Tumbes, afectados por la enfermedad aguda de la necrosis del
hepatopáncreas (AHPND). De estas cepas, se aislaron cuatro plásmidos conteniendo el gen PirA-B, y
se obtuvieron las secuencias nucleotídicas de los mismos. Se realizó un análisis de similitud de dichas
secuencias con 7 secuencias de plásmidos similares reportadas en GenBank, con las cuales se realizó un
análisis de alineamiento múltiple y cálculo de distancias genéticas. Los resultados muestran que tres de
los plásmidos aislados presentan un tamaño promedio de 75.29 kb, y un plásmido presentaba un tamaño
menor (37.71 kb). Todos los plásmidos aislados presentaron secuencias nucleotídicas muy similares
entre sí y tres presentaban una gran similitud de secuencia con una de las obtenidas de GenBank, con
código de acceso CP097860 proveniente de China. Sólo un plásmido de Tumbes presentó mayor
divergencia con esta secuencia de referencia.
Palabras clave: AHPND, plásmidos, Vibrio, distancias genéticas
1 Autor principal
Correspondencia: rsalas@unfv.edu.pe
pág. 42
Genetic distances of Vibrio spp plasmids isolated from free-living shrimps
afected by acute hepatopáncreas necrosis disease, Tumbes, Peru
ABSTRACT
Vibrio spp. strains bearing toxin PirA-B genes were isolated from shrimps of Tumbes estuaries affected
by Acute Hepatopancreas Necrosis Disease (AHPND). From these strains, four PirA-B positive
plasmids were obtained, three with an average size of 75.29 kb and one with 37.71 kb. These plasmids
were sequenced and compaired between them and with seven sequences obtained from Genbank.
Results showed a greater similarity between these sequences and with one of GenBank, from China,
with accession number CP097860. Only one Tumbes plasmid showed greater divergency with this
reference sequence.
Key words: AHPND, Vibrio, plasmids, genetic distances.
Artículo recibido 09 agosto 2025
Aceptado para publicación: 13 septiembre 2025
Genetic distances of Vibrio spp plasmids isolated from free-living shrimps
afected by acute hepatopáncreas necrosis disease, Tumbes, Peru
ABSTRACT
Vibrio spp. strains bearing toxin PirA-B genes were isolated from shrimps of Tumbes estuaries affected
by Acute Hepatopancreas Necrosis Disease (AHPND). From these strains, four PirA-B positive
plasmids were obtained, three with an average size of 75.29 kb and one with 37.71 kb. These plasmids
were sequenced and compaired between them and with seven sequences obtained from Genbank.
Results showed a greater similarity between these sequences and with one of GenBank, from China,
with accession number CP097860. Only one Tumbes plasmid showed greater divergency with this
reference sequence.
Key words: AHPND, Vibrio, plasmids, genetic distances.
Artículo recibido 09 agosto 2025
Aceptado para publicación: 13 septiembre 2025
pág. 43
INTRODUCCIÓN
El cultivo de langostinos se ha vuelto una actividad económica muy importante en el norte del Perú, por
lo que merece una vigilancia respecto a la prevalencia de enfermedades que puedan disminuir la
productividad. Dentro de las patologías que pueden afectar los cultivos de langostinos, la enfermedad
de la necrosis aguda del hepatopáncreas (AHPND) genera una tasa de mortalidad que llegó hasta el
100% entre el 2009 y el 2011 en zonas del sudeste de Asia (Varela-Mejías et al., 2017), mientras que en
el año 2013 la mortalidad alcanzó un valor de 65% en México (Varela-Mejías y Peña-Navarro, 2014).
En el norte del Perú la presencia de bacterias portadoras de genes para la toxina pirA-B ha sido menor
al 50% (Velazco et al., 2022), debido a que posiblemente en las poblaciones de América del Sur se
genera una fase crónica más que aguda de AHPND (Aranguren et al., 2020).
Han et al. (2015) identificaron un plásmido de 69 kb (al que llamaron pVPA3-1, luego conocido como
pVA1) en cepas de V. parahaemolyticus que causaban AHPND. El secuenciamiento del plásmido
mostró la presencia de 92 marcos de lectura (ORF por sus siglas en inglés), que codificaban además de
proteínas de movilidad, enzimas de replicación, transposasas y proteínas de virulencia, los genes para
una toxina binaria similar a la que produce la bacteria Photorhabdus, un comensal de nemátodos
entomopatógenos, por lo que la toxina fue llamada Pir y los dos genes asociados, pirA y pirB. Lee et
al. (2015) demostraron que este plásmido puede trasmitirse de una bacteria del género Vibrio generadora
de AHPND a otra que no genera esta enfermedad y volverla virulenta. De igual forma, Muthukrishnan
et al. (2019) detectaron transferencia genética horizontal de genes PirA-B desde cepas de V.
parahaemolyiticus positivas para AHPND a cepas no productoras de la enfermedad e incluso a especies
de géneros diferentes como Algoriphagus parahaemolyticus Han et al. (2017) también aislaron e
identificaron 4 cepas de V. campbelli portadoras del gen PirA-B y generadora de AHPND y Liu et al.
(2018) identificaron una cepa de V. owensii productora de AHPND en Litopenaeus vannamei. Estos
resultados sugieren la posibilidad de que los genes para esta toxina se hayan distribuido de manera
horizontal entre diversas especies del género Vibrio, quizá asociándose a transposones (Xiao et al.,
2017). Esta transferencia horizontal podría generar diversidad genética, por lo que el objetivo del
presente trabajo es analizar las diferencias genéticas existentes en plásmidos portadores de los genes
INTRODUCCIÓN
El cultivo de langostinos se ha vuelto una actividad económica muy importante en el norte del Perú, por
lo que merece una vigilancia respecto a la prevalencia de enfermedades que puedan disminuir la
productividad. Dentro de las patologías que pueden afectar los cultivos de langostinos, la enfermedad
de la necrosis aguda del hepatopáncreas (AHPND) genera una tasa de mortalidad que llegó hasta el
100% entre el 2009 y el 2011 en zonas del sudeste de Asia (Varela-Mejías et al., 2017), mientras que en
el año 2013 la mortalidad alcanzó un valor de 65% en México (Varela-Mejías y Peña-Navarro, 2014).
En el norte del Perú la presencia de bacterias portadoras de genes para la toxina pirA-B ha sido menor
al 50% (Velazco et al., 2022), debido a que posiblemente en las poblaciones de América del Sur se
genera una fase crónica más que aguda de AHPND (Aranguren et al., 2020).
Han et al. (2015) identificaron un plásmido de 69 kb (al que llamaron pVPA3-1, luego conocido como
pVA1) en cepas de V. parahaemolyticus que causaban AHPND. El secuenciamiento del plásmido
mostró la presencia de 92 marcos de lectura (ORF por sus siglas en inglés), que codificaban además de
proteínas de movilidad, enzimas de replicación, transposasas y proteínas de virulencia, los genes para
una toxina binaria similar a la que produce la bacteria Photorhabdus, un comensal de nemátodos
entomopatógenos, por lo que la toxina fue llamada Pir y los dos genes asociados, pirA y pirB. Lee et
al. (2015) demostraron que este plásmido puede trasmitirse de una bacteria del género Vibrio generadora
de AHPND a otra que no genera esta enfermedad y volverla virulenta. De igual forma, Muthukrishnan
et al. (2019) detectaron transferencia genética horizontal de genes PirA-B desde cepas de V.
parahaemolyiticus positivas para AHPND a cepas no productoras de la enfermedad e incluso a especies
de géneros diferentes como Algoriphagus parahaemolyticus Han et al. (2017) también aislaron e
identificaron 4 cepas de V. campbelli portadoras del gen PirA-B y generadora de AHPND y Liu et al.
(2018) identificaron una cepa de V. owensii productora de AHPND en Litopenaeus vannamei. Estos
resultados sugieren la posibilidad de que los genes para esta toxina se hayan distribuido de manera
horizontal entre diversas especies del género Vibrio, quizá asociándose a transposones (Xiao et al.,
2017). Esta transferencia horizontal podría generar diversidad genética, por lo que el objetivo del
presente trabajo es analizar las diferencias genéticas existentes en plásmidos portadores de los genes
pág. 44
PirA-B extraídos de cepas de Vibrio parahaemolyticus aisladas de langostinos de vida libre en Tumbes,
Perú.
MÉTODOLOGIA
Obtención de Muestras
Se colectaron langostinos de vida libre con síntomas de AHPND (Velazco et al., 2022) en los estuarios
cercanos a granjas langostineras de la localidad de Tumbes. Se extrajeron hepatopáncreas de los
animales colectados, los cuales fueron homogenizados en morteros utilizando agua peptonada alcalina.
Se tomaron 5 mL de cada homogenizado, a partir de los cuales se realizaron cultivos en placas Petri que
contenían Agar Tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa (TCBS, Merck) como medio selectivo
específico para el género Vibrio. Las placas fueron mantenidas en incubación a 37°C y se realizaron
lecturas a las 24 y 48 horas. Las colonias que desarrollaron en el medio TCBS y presentaron
características microscópicas del género Vibrio (morfología y coloración Gram negativa) fueron
resuspendidas en solución salina estéril y centrifugadas a 5000 rpm por 15 minutos. Luego se realizó
un segundo lavado finalmente dejándolas en buffer TE 1X a pH 8.0. Se realizó una incubación a 90°C
por 10 minutos e inmediatamente se trasladaron estas muestras a -20°C por 5 minutos. Luego, se
centrifugaron las muestras a 12000 rpm por 1 minuto, y el sobrenadante fue almacenado a -50° C hasta
su utilización posterior. Se procedió a identificar las muestras que presentaban el gen PirA-B mediante
la técnica de Nested-PCR (Dangtip et al., 2015).
Secuenciamiento y análisis bioinformático.
De las bacterias seleccionadas del género Vibrio, se aislaron plásmidos que contenían los genes para la
toxina binaria PirA-B mediante el uso del protocolo High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Se
enviaron muestras de cuatro plásmidos a la empresa Umbrella Genomics S.A. (Lima, Perú) para realizar
el secuenciamiento mediante el sistema Illumina NovaSeq 6000. Paralelamente, se buscaron secuencias
de plásmidos PirA-B positivas en la base de datos de GenBank del National Center for Biotechnology
Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Todas las secuencias en formato FASTA fueron
analizadas mediante alineamiento múltiple utilizando el programa Clustal Omega a través del servidor
del European Molecular Biology Laboratory (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Las
secuencias alineadas fueron luego analizadas mediante el programa MEGA11 (Tamura, Stecher y
PirA-B extraídos de cepas de Vibrio parahaemolyticus aisladas de langostinos de vida libre en Tumbes,
Perú.
MÉTODOLOGIA
Obtención de Muestras
Se colectaron langostinos de vida libre con síntomas de AHPND (Velazco et al., 2022) en los estuarios
cercanos a granjas langostineras de la localidad de Tumbes. Se extrajeron hepatopáncreas de los
animales colectados, los cuales fueron homogenizados en morteros utilizando agua peptonada alcalina.
Se tomaron 5 mL de cada homogenizado, a partir de los cuales se realizaron cultivos en placas Petri que
contenían Agar Tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa (TCBS, Merck) como medio selectivo
específico para el género Vibrio. Las placas fueron mantenidas en incubación a 37°C y se realizaron
lecturas a las 24 y 48 horas. Las colonias que desarrollaron en el medio TCBS y presentaron
características microscópicas del género Vibrio (morfología y coloración Gram negativa) fueron
resuspendidas en solución salina estéril y centrifugadas a 5000 rpm por 15 minutos. Luego se realizó
un segundo lavado finalmente dejándolas en buffer TE 1X a pH 8.0. Se realizó una incubación a 90°C
por 10 minutos e inmediatamente se trasladaron estas muestras a -20°C por 5 minutos. Luego, se
centrifugaron las muestras a 12000 rpm por 1 minuto, y el sobrenadante fue almacenado a -50° C hasta
su utilización posterior. Se procedió a identificar las muestras que presentaban el gen PirA-B mediante
la técnica de Nested-PCR (Dangtip et al., 2015).
Secuenciamiento y análisis bioinformático.
De las bacterias seleccionadas del género Vibrio, se aislaron plásmidos que contenían los genes para la
toxina binaria PirA-B mediante el uso del protocolo High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Se
enviaron muestras de cuatro plásmidos a la empresa Umbrella Genomics S.A. (Lima, Perú) para realizar
el secuenciamiento mediante el sistema Illumina NovaSeq 6000. Paralelamente, se buscaron secuencias
de plásmidos PirA-B positivas en la base de datos de GenBank del National Center for Biotechnology
Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Todas las secuencias en formato FASTA fueron
analizadas mediante alineamiento múltiple utilizando el programa Clustal Omega a través del servidor
del European Molecular Biology Laboratory (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Las
secuencias alineadas fueron luego analizadas mediante el programa MEGA11 (Tamura, Stecher y
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Kumar, 2021) para calcular distancias genéticas usando el método de Máxima Verosimilitud Compuesta
y generar un árbol filogenético mediante el método de Máxima Verosimilitud y siguiendo el modelo de
Tamura-Nei.
RESULTADOS
Análisis de alineamiento múltiple
Se analizaron en total once secuencias de plásmidos, siete de las cuales fueron identificadas en la base
de datos GenBank y cuatro fueron de los plásmidos aislados de bacterias del género Vibrio presentes en
langostinos afectados por AHPND en Tumbes (B1E, A31C, A3B, B1A) La Tabla 1 muestra los tamaños
de los plásmidos usados, los cuales fluctúan entre 67089 a 78471 pb, a excepción de un plásmido (B1A)
obtenido a partir de las muestras de Tumbes y que presentaba un tamaño menor (37709 pb).
Tabla 1.
Secuencias analizadas en el presente trabajo. Las secuencias marcadas con un asterisco son las
muestras de plásmidos provenientes de las cepas aisladas en Tumbes.
Código de Secuencia Tamaño (pb)
CP065372 67093
AP014860 69078
KM067908 69168
CP020036 69227
KP324996 70452
CP097860 77278
CP083364 67089
B1E* 78471
A31C* 73283
A3B* 74118
B1A* 37709
El alineamiento múltiple mediante el programa Clustal Omega permitió identificar que los plásmidos
analizados presentaban una gran variabilidad en cuanto a su secuencia nucleotídica, la cual se puede
demostrar al calcular las distancias genéticas (Tabla 2), observándose que los plásmidos obtenidos de
las cepas de Vibrio aisladas en Tumbes, sólo se encontraban con menor distancia entre sí y con la
secuencia del plásmido de accesión CP097860 en Genbank, aislada de cepas de Vibrio owensii en China,
con solo la excepción del plásmido A3B, con la que se puede observar una distancia relativamente
Kumar, 2021) para calcular distancias genéticas usando el método de Máxima Verosimilitud Compuesta
y generar un árbol filogenético mediante el método de Máxima Verosimilitud y siguiendo el modelo de
Tamura-Nei.
RESULTADOS
Análisis de alineamiento múltiple
Se analizaron en total once secuencias de plásmidos, siete de las cuales fueron identificadas en la base
de datos GenBank y cuatro fueron de los plásmidos aislados de bacterias del género Vibrio presentes en
langostinos afectados por AHPND en Tumbes (B1E, A31C, A3B, B1A) La Tabla 1 muestra los tamaños
de los plásmidos usados, los cuales fluctúan entre 67089 a 78471 pb, a excepción de un plásmido (B1A)
obtenido a partir de las muestras de Tumbes y que presentaba un tamaño menor (37709 pb).
Tabla 1.
Secuencias analizadas en el presente trabajo. Las secuencias marcadas con un asterisco son las
muestras de plásmidos provenientes de las cepas aisladas en Tumbes.
Código de Secuencia Tamaño (pb)
CP065372 67093
AP014860 69078
KM067908 69168
CP020036 69227
KP324996 70452
CP097860 77278
CP083364 67089
B1E* 78471
A31C* 73283
A3B* 74118
B1A* 37709
El alineamiento múltiple mediante el programa Clustal Omega permitió identificar que los plásmidos
analizados presentaban una gran variabilidad en cuanto a su secuencia nucleotídica, la cual se puede
demostrar al calcular las distancias genéticas (Tabla 2), observándose que los plásmidos obtenidos de
las cepas de Vibrio aisladas en Tumbes, sólo se encontraban con menor distancia entre sí y con la
secuencia del plásmido de accesión CP097860 en Genbank, aislada de cepas de Vibrio owensii en China,
con solo la excepción del plásmido A3B, con la que se puede observar una distancia relativamente
pág. 46
mayor. La Tabla 2 también muestra distancias relativamente cercanas con dos secuencias más, también
provenientes de Asia (Tabla 3) y relativamente cercanas con la secuencia de accesión CP097860. Estos
resultados son confirmados por el árbol filogenético correspondiente (Figura 1).
mayor. La Tabla 2 también muestra distancias relativamente cercanas con dos secuencias más, también
provenientes de Asia (Tabla 3) y relativamente cercanas con la secuencia de accesión CP097860. Estos
resultados son confirmados por el árbol filogenético correspondiente (Figura 1).
pág. 47
Tabla 2.
Matriz de distancias genéticas de los plásmidos analizados. En color gris se muestran las distancias genéticas entre los plásmidos provenientes de Tumbes, en
color azul se muestran las distancias genéticas entre estos plásmidos con la accesión CP097860 del GenBank, y en color verde con las de otras tres accesiones.
CP065372 AP014860 KM067908 CP020036 B1E A31C A3B B1A CP097860 KP324996
CP065372
AP014860 0.044258
KM067908 0.053748 0.019996
CP020036 0.044198 0.000279 0.019832
B1E 4.633039 4.624457 4.299378 4.632856
A31C 4.559811 4.578700 4.247131 4.586147 0.008227
A3B 4.265144 4.296798 3.857295 4.296218 0.000096 0.000147
B1A 4.169113 4.243249 3.724478 4.256210 0.000085 0.000170 0.000064
CP097860 4.169605 4.234551 3.754334 4.245985 0.000070 0.000026 0.029798 0.000071
KP324996 4.519685 4.596273 4.690814 4.604474 0.027897 0.028172 0.028966 0.031065 0.028205
CP083364 4.622752 4.616766 4.584102 4.625146 0.038219 0.037100 0.021052 0.007465 0.020628 0.050458
Tabla 2.
Matriz de distancias genéticas de los plásmidos analizados. En color gris se muestran las distancias genéticas entre los plásmidos provenientes de Tumbes, en
color azul se muestran las distancias genéticas entre estos plásmidos con la accesión CP097860 del GenBank, y en color verde con las de otras tres accesiones.
CP065372 AP014860 KM067908 CP020036 B1E A31C A3B B1A CP097860 KP324996
CP065372
AP014860 0.044258
KM067908 0.053748 0.019996
CP020036 0.044198 0.000279 0.019832
B1E 4.633039 4.624457 4.299378 4.632856
A31C 4.559811 4.578700 4.247131 4.586147 0.008227
A3B 4.265144 4.296798 3.857295 4.296218 0.000096 0.000147
B1A 4.169113 4.243249 3.724478 4.256210 0.000085 0.000170 0.000064
CP097860 4.169605 4.234551 3.754334 4.245985 0.000070 0.000026 0.029798 0.000071
KP324996 4.519685 4.596273 4.690814 4.604474 0.027897 0.028172 0.028966 0.031065 0.028205
CP083364 4.622752 4.616766 4.584102 4.625146 0.038219 0.037100 0.021052 0.007465 0.020628 0.050458
pág. 48
Tabla 3.
Origen y microorganismo del que provienen las accesiones con menor distancia respecto a las
secuencias de los plásmidos aislados de Tumbes.
Código GenBank Microorganismo Procedencia
KP324996 V. parahaemolyticus Tailandia, Vietnam
CP097860 V. owensii China
CP083364 V. parahaemolyticus Corea del Sur
Figura 1.
Árbol filogenético de las 11 secuencias de plásmidos positivos a los genes para la toxina PirA-B
utilizadas en el presente trabajo.
DISCUSIÓN
Existen referencias que indican la necesidad de otros factores además de la toxina PirA-B para generar
la enfermedad aguda de la necrosis del hepatopáncreas (AHPND). Ramirez et al. (2020) aislaron cinco
cepas de Vibrio parahaemolyticus positivas por PCR a los genes PirA-B, de las cuales dos cepas
produjeron mortalidad y daños histológicos concordantes con la AHPND, pero otras dos no eran
patogénicas pese a tener también los genes para la toxina. Ahmed et al. (2022) señalaron que, además
del gen para la toxina binaria PirA-B, el plásmido adquiere algunos otros factores de virulenciaB1E PLASM
B1A PLASM
A31C PLASM
A3B-PLASM
KP324996
CP097860
CP083364
KM067908
AP014860
CP065372
CP020036
Tabla 3.
Origen y microorganismo del que provienen las accesiones con menor distancia respecto a las
secuencias de los plásmidos aislados de Tumbes.
Código GenBank Microorganismo Procedencia
KP324996 V. parahaemolyticus Tailandia, Vietnam
CP097860 V. owensii China
CP083364 V. parahaemolyticus Corea del Sur
Figura 1.
Árbol filogenético de las 11 secuencias de plásmidos positivos a los genes para la toxina PirA-B
utilizadas en el presente trabajo.
DISCUSIÓN
Existen referencias que indican la necesidad de otros factores además de la toxina PirA-B para generar
la enfermedad aguda de la necrosis del hepatopáncreas (AHPND). Ramirez et al. (2020) aislaron cinco
cepas de Vibrio parahaemolyticus positivas por PCR a los genes PirA-B, de las cuales dos cepas
produjeron mortalidad y daños histológicos concordantes con la AHPND, pero otras dos no eran
patogénicas pese a tener también los genes para la toxina. Ahmed et al. (2022) señalaron que, además
del gen para la toxina binaria PirA-B, el plásmido adquiere algunos otros factores de virulenciaB1E PLASM
B1A PLASM
A31C PLASM
A3B-PLASM
KP324996
CP097860
CP083364
KM067908
AP014860
CP065372
CP020036
pág. 49
relacionados directamente a la patogenicidad. Por lo tanto, se requiere analizar la variabilidad
nucleotídica en la secuencia de los genes de estos plásmidos para detectar cambios en la secuencia de
los genes para la toxina PirA-B o de otros factores genéticos que podrían estar relacionados con la
enfermedad de la AHPND. El presente trabajo muestra resultados iniciales de este tipo de análisis
presentando datos de distancias genéticas.
En la toma de muestra se aislaron cepas del género Vibrio sin determinar la especie debido a que se sabe
que los genes para la toxina PirA-B no están presentes en una sola especie bacteriana, lo que se debería
a transferencia genética de tipo horizontal. Dong et al. (2019) demostraron que plásmidos del tipo pVA1
que llevan los genes para la toxina binaria PirA-B, pueden ser transferidos de cepas poseedoras causantes
de AHPND a bacterias no patogénicas, a través de mecanismos conjugativos. Esta transferencia
horizontal de plásmidos se vería facilitada principalmente entre bacterias estrechamente relacionadas,
como las halofílicas Vibrio parahaemolyticus, V. campbellii y V. owensii que colonizan los mismos
nichos marinos (Liu et al., 2018).
En el presente trabajo, se aislaron plásmidos de cepas de Vibrio asociadas a langostinos de los estuarios
de Tumbes que desarrollaron AHPND, cuatro de los cuales fueron secuenciados, tres con una longitud
promedio de 75.29 kb y un rango entre 73 y 78 kb, lo cual está más cercano a la longitud descrita del
plásmido PVA1 (Lee et al., 2015). Sin embargo, un cuarto plásmido presentó una secuencia de 37.71
kb (Tabla 1). La Tabla 2 muestra que los plásmidos aislados en Tumbes presentaron una menor distancia
genética con el plásmido de accesión CP097860, proveniente de China (Tabla 3), con la única excepción
del plásmido A3B, aunque manteniéndose aún cercano al CP097860 que a los otros plásmidos obtenidos
de GenBank. Los resultados de las distancias genéticas calculadas estarían dando inferencias respecto
al desarrollo filogenético de estos plásmidos (Figura 1) a partir de secuencias de plásmidos de tipo PVA1
provenientes del Asia, como el plásmido de accesión CP097860, lo cual permite considerar qué
secuencias corresponden a plásmidos que inicialmente estuvieron asociados a la AHPND en Tumbes, y
cómo han ido variando en un camino propio en esta región (Figura 2). Este análisis es factible debido
al uso del programa MEGA, el cual utiliza las distancias calculadas como base para la construcción de
árboles filogenéticos. Es importante señalar que el único requisito del programa MEGA es el análisis
relacionados directamente a la patogenicidad. Por lo tanto, se requiere analizar la variabilidad
nucleotídica en la secuencia de los genes de estos plásmidos para detectar cambios en la secuencia de
los genes para la toxina PirA-B o de otros factores genéticos que podrían estar relacionados con la
enfermedad de la AHPND. El presente trabajo muestra resultados iniciales de este tipo de análisis
presentando datos de distancias genéticas.
En la toma de muestra se aislaron cepas del género Vibrio sin determinar la especie debido a que se sabe
que los genes para la toxina PirA-B no están presentes en una sola especie bacteriana, lo que se debería
a transferencia genética de tipo horizontal. Dong et al. (2019) demostraron que plásmidos del tipo pVA1
que llevan los genes para la toxina binaria PirA-B, pueden ser transferidos de cepas poseedoras causantes
de AHPND a bacterias no patogénicas, a través de mecanismos conjugativos. Esta transferencia
horizontal de plásmidos se vería facilitada principalmente entre bacterias estrechamente relacionadas,
como las halofílicas Vibrio parahaemolyticus, V. campbellii y V. owensii que colonizan los mismos
nichos marinos (Liu et al., 2018).
En el presente trabajo, se aislaron plásmidos de cepas de Vibrio asociadas a langostinos de los estuarios
de Tumbes que desarrollaron AHPND, cuatro de los cuales fueron secuenciados, tres con una longitud
promedio de 75.29 kb y un rango entre 73 y 78 kb, lo cual está más cercano a la longitud descrita del
plásmido PVA1 (Lee et al., 2015). Sin embargo, un cuarto plásmido presentó una secuencia de 37.71
kb (Tabla 1). La Tabla 2 muestra que los plásmidos aislados en Tumbes presentaron una menor distancia
genética con el plásmido de accesión CP097860, proveniente de China (Tabla 3), con la única excepción
del plásmido A3B, aunque manteniéndose aún cercano al CP097860 que a los otros plásmidos obtenidos
de GenBank. Los resultados de las distancias genéticas calculadas estarían dando inferencias respecto
al desarrollo filogenético de estos plásmidos (Figura 1) a partir de secuencias de plásmidos de tipo PVA1
provenientes del Asia, como el plásmido de accesión CP097860, lo cual permite considerar qué
secuencias corresponden a plásmidos que inicialmente estuvieron asociados a la AHPND en Tumbes, y
cómo han ido variando en un camino propio en esta región (Figura 2). Este análisis es factible debido
al uso del programa MEGA, el cual utiliza las distancias calculadas como base para la construcción de
árboles filogenéticos. Es importante señalar que el único requisito del programa MEGA es el análisis
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previo de alineamiento múltiple de las secuencias a usar, el cual puede ser realizado por el mismo
programa o por otros programas, como Clustal Omega o MUSCLE (Awe et al., 2023).
Figura 2.
Relaciones evolutivas proyectadas a partir del cálculo de distancias genéticas entre los plásmidos
aislados a partir de bacterias positivas a los genes de la toxina PirA-B presentes en los estuarios de
Tumbes y la secuencia del plásmido con accesión CP097860 de GenBank.
Pese a las diferencias nucleotídicas que permiten calcular las distancias genéticas, todas las secuencias
utilizadas en el presente trabajo provienen de cepas bacterianas generadoras de AHPND, lo que
implicaría que los genes responsables de la enfermedad deben estar en todos estos plásmidos, y que las
variaciones en cuanto al desarrollo y/o la gravedad de la misma dependerían de la variación de las
secuencias dentro de estos genes conservados.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ahmed J, Khan MH, Unnikrishnan S, Ramalingam K. 2021. Acute Hepatopancreases Necrosis Diseases
(AHPND) as Challenging Threat in Shrimp. Biointerface Research in Applied Chemistry 12(1):
978-991
Aranguren LF, Mai HN, Noble B, Dhar AK. 2020. Acute hepatopancreatic necrosis disease (VP
AHPND), a chronic disease in shrimp Penaeus vannamei population raised in Latin America,
Journal of Invertebrate Pathology [Internet], [15 abril 2023]. Disponible en:
https://doi.org/10.1016/j.jip.2020.107424
previo de alineamiento múltiple de las secuencias a usar, el cual puede ser realizado por el mismo
programa o por otros programas, como Clustal Omega o MUSCLE (Awe et al., 2023).
Figura 2.
Relaciones evolutivas proyectadas a partir del cálculo de distancias genéticas entre los plásmidos
aislados a partir de bacterias positivas a los genes de la toxina PirA-B presentes en los estuarios de
Tumbes y la secuencia del plásmido con accesión CP097860 de GenBank.
Pese a las diferencias nucleotídicas que permiten calcular las distancias genéticas, todas las secuencias
utilizadas en el presente trabajo provienen de cepas bacterianas generadoras de AHPND, lo que
implicaría que los genes responsables de la enfermedad deben estar en todos estos plásmidos, y que las
variaciones en cuanto al desarrollo y/o la gravedad de la misma dependerían de la variación de las
secuencias dentro de estos genes conservados.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ahmed J, Khan MH, Unnikrishnan S, Ramalingam K. 2021. Acute Hepatopancreases Necrosis Diseases
(AHPND) as Challenging Threat in Shrimp. Biointerface Research in Applied Chemistry 12(1):
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Aranguren LF, Mai HN, Noble B, Dhar AK. 2020. Acute hepatopancreatic necrosis disease (VP
AHPND), a chronic disease in shrimp Penaeus vannamei population raised in Latin America,
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https://doi.org/10.1016/j.jip.2020.107424
pág. 51
Awe OI, En najih N, Nyamari MN, Mukanga, LB. 2023. Comparative study between molecular and
genetic evolutionary análisis tolos using African SARS-CoV-2 variants. Informatics in
Medicine Unlocked [Internet], [8 enero 20224]. 36, 101143. Disponible en
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352914822002805
Dangtip, S., Sirikharin, R., Sanguanrut, P., Thitamadee, S., Sritunyalucksana, K., Taengchaiyaphum, S.,
Mavichak, R., Proespraiwong, P. y Flegel, T.W. (2015). AP4 method for two-tube nested PCR
detection of AHPND isolates of Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture Reports, 2, 158–162.
DOI: 10.1016/j.aqrep.2015.10.002
Dong X, Song J, Chen J, Bi D, Wang W, Ren Y, Wang H, Wang G, Tang K, Wang X, Huang J. 2019.
Conjugative Transfer of the pVA1-Type Plasmid Carrying then pirABvp Genes Results in the
Formation of New AHPND-Causing Vibrio. Frontiers in cellular and infection microbiology 9:
195
Han JE, Tang KFJ, Tran LH, Lightner DV. 2015. Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in
a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis
disease (AHPND) of shrimp. Diseases of aquatic organisms 113: 33–40
Han JE, Tang KFJ, Aranguren LF, Piamsomboon P. 2017. Characterization and pathogenicity of acute
hepatopancreatic necrosis disease natural mutants, pirABvp (‐) V. parahaemolyticus, and
pirABvp (+) V. campbellii strains. Aquaculture 470: 84–90
Lee CT, Chen IT, Yang YT, Ko TP, Huang YT, Huang JY, Huang MF, Lin SJ, Chen CY, Linh SS,
Lightner DV, Wang HC, Wang AHJ, Wang HC, Horb LI, Lo CF. 2015. The opportunistic
marine pathogen Vibrio parahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid that
expresses a deadly toxin. PNAS: 112(34): 10798–10803
Liu L, Xiao J, Zhang M, Zhu W, Xia X, Dai X, Pan Y, Yan S, Wang Y. 2018. A Vibrio owensii strain
as the causative agent of AHPND in cultured shrimp, Litopenaeus vannamei. Journal of
Invertebrate Pathology 153: 156-164
Muthukrishnan S, Defoirdt T, Din M, Yasin I, Yusoff F, Ikhsan N. 2019. Horizontal gene transfer of
the pirAB genes responsible for Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) turns a
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Mavichak, R., Proespraiwong, P. y Flegel, T.W. (2015). AP4 method for two-tube nested PCR
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Conjugative Transfer of the pVA1-Type Plasmid Carrying then pirABvp Genes Results in the
Formation of New AHPND-Causing Vibrio. Frontiers in cellular and infection microbiology 9:
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a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis
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non-Vibrio strain into an AHPND-positive pathogen. bioRxiv 2019.12.20.884320 [Internet], [4
abril 2023]. Disponible en: https://doi.org/10.1101/2019.12.20.884320
Ramirez B, Guevara M, Montoya V, Serna M. 2020. Evaluación de la patogenicidad de cepas de Vibrio
parahaemolyticus que contienen los genes pirA Y pirB aislados de Penaeus vannamei de cultivo.
Bol Inst Mar Perú 35(2): 242-256
Tamura K, Stecher G, Kumar S. 2021. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version
11. Molecular Biology and Evolution 38: 3022-3027
Varela-Mejías A, Peña-Navarro N. 2014. Síndrome de la Mortalidad Temprana (EMS/AHPNS) en
camarones cultivados: Una revisión. Repertorio Científico 17(1): 25-30
Varela-Mejías A, Peña-Navarro N, Aranguren-Caro LF. 2017. Necrosis aguda del hepatopáncreas: una
revisión de la enfermedad en Penaeus vannamei. Agronomía Mesoamericana 28(3): 735-745
Velazco RZ, Rodrigo ME, Salcedo LA, Lazábara ID, Delgado LG, Salas-Asencios R. 2022. Detección
molecular de la enfermedad de la necrosis aguda del hepatopáncreas en muestras de langostinos
de la región de tumbes. Ciencia Latina Revista Científica Multidisciplinar 6(1): 1478-1491
Xiao J, Liu L, Ke Y, Li X, Liu Y, Pan Y, Yan S, Wang Y. 2017. Shrimp AHPND-causing plasmids
encoding the PirAB toxins as mediated by pirAB-Tn903 are prevalent in various Vibrio species.
Nature Scientific Reports 7: 42177. DOI: 10.1038/srep42177
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