INDUCCIÓN DE TUMORES IN OVO PARA EL
ESTUDIO DEL EFECTO ANTITUMORAL DEL
EXTRACTO DE AJO ENVEJECIDO
INDUCTION OF IN OVO TUMORS FOR THE STUDY OF THE
ANTITUMOR EFFECT OF AGED GARLIC EXTRACT
Carlos César Patiño Morales
Universidad Autónoma Metropolitana Cuajimalpa
Ricardo Jaime Cruz
Universidad Tecnológica de México-Campus Sur
Laura Villavicencio Guzmán
Hospital Infantil de México Federico Gómez, México
Marcela Salazar García
Hospital Infantil de México Federico Gómez, México
pág. 899
DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v9i5.19745
Inducción de Tumores in ovo para el Estudio del Efecto Antitumoral del
Extracto de Ajo Envejecido
Carlos César Patiño Morales 1
carloscesarpmorales@gmail.com
https://orcid.org/0000-0003-1995-0308
Hospital Infantil de México Federico Gómez
México
Universidad Autónoma Metropolitana
Cuajimalpa
Ricardo Jaime Cruz
ricardo.jaime.cruz@gmail.com
https://orcid.org/0000-0002-0403-537X
Universidad Tecnológica de México-Campus
Sur
México
Laura Villavicencio Guzmán
lauvillavi@gmail.com
https://orcid.org/0000-0002-8314-8996
Hospital Infantil de México Federico Gómez
México
Marcela Salazar García
msalazar@himfg.edu.mx
https://orcid.org/0000-0001-5318-8148
Hospital Infantil de México Federico Gómez
México
RESUMEN
En este trabajo se analizó el efecto del extracto de ajo envejecido (EAE) en células HeLa de cáncer
cervicouterino mediante observación de cambios morfológicos, ensayo de viabilidad (MTT) y medición
de p53 por western blot. En el modelo in ovo, se inocularon 4x10⁶ células en la membrana
corioalantoidea de embriones de pollo para generar tumores, posteriormente tratados con EAE. Se
incluyó un grupo control y dos grupos con tratamiento, con seis embriones por grupo (calculados
mediante G power). Se evaluó el tamaño tumoral mediante análisis morfométrico y la expresión de p53
por inmunohistoquímica. Los datos se analizaron con Kruskall Wallis y prueba de Dunn. En el modelo
in vitro, el EAE al 10% y 20% produjo cambios morfológicos compatibles con muerte celular, reducción
de viabilidad y aumento de p53 en forma dosis-dependiente. En el modelo in vivo, el tratamiento con
EAE redujo aproximadamente 50% el tamaño tumoral e incrementó la expresión de p53 en el tejido. El
extracto de ajo envejecido presenta un efecto antitumoral en células HeLa, posiblemente mediado por
la sobreexpresión de p53. Dicho efecto se observa tanto in vitro como in vivo
Palabras clave: antitumoral, cáncer, extracto de ajo envejecido, HeLa, In ovo
1
Autor principal
Correspondencia: msalazar@himfg.edu.mx
pág. 900
Induction of In Ovo Tumors for the Study of the Antitumor Effect of Aged
Garlic Extract
ABSTRACT
In this study, the effect of aged garlic extract (AGE) was analyzed in HeLa cervical cancer cells through
the observation of morphological changes, a viability assay (MTT), and p53 measurement by western
blot. In the in ovo model, 4×10⁶ cells were inoculated into the chorioallantoic membrane of chicken
embryos to generate tumors, which were subsequently treated with AGE. A control group and two
treatment groups were included, with six embryos per group (sample size calculated using G*Power).
Tumor size was evaluated through morphometric analysis, and p53 expression was assessed by
immunohistochemistry. Data were analyzed using the Kruskal–Wallis test followed by Dunn’s post hoc
test. In the in vitro model, AGE at 10% and 20% induced morphological changes consistent with cell
death, reduced viability, and increased p53 expression in a dose-dependent manner. In the in ovo model,
AGE treatment reduced tumor size by approximately 50% and increased p53 expression in the tissue.
Aged garlic extract exerts an antitumor effect on HeLa cells, possibly mediated by p53 overexpression.
This effect is observed both in vitro and in vivo.
Keywords: antitumor, cancer, aged garlic extract, HeLa, In ovo
Artículo recibido 23 agosto 2023
Aceptado para publicación: 26 septiembre 2023
pág. 901
INTRODUCCIÓN
El cáncer cervicouterino (CaCu) continúa siendo un problema importante de salud. Aunque se ha
avanzado mucho en su prevención, todavía hay mujeres que mueren por esta enfermedad. Se sabe que
la infección con el virus del papiloma humano es una causa necesaria pero no suficiente para el
desarrollo del cáncer, debido a que además de la infección entran en juego múltiples factores como lo
propios del virus (la persistencia, la carga viral o la variante) o propios de la paciente (como el estado
físico e inmunológico, la edad de la menarca, el número de partos por canal vaginal, y hábitos como
fumar o el consumo de alcohol) [1]. El tratamiento actual de este tipo de tumores consiste en
radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, terapia inmunológica y cirugía, sin embargo, se han
reportado tumores que son resistentes al tratamiento [2]. Es por ello que se sigue en la búsqueda de
nuevas alternativas terapéuticas o moléculas coadyuvantes que sean efectivas para eliminar las células
tumorales de manera selectiva, pero que a su vez sean accesibles para toda la población y que no afecten
la calidad de vida de los pacientes. Los compuestos naturales han llamado la atención por su efectividad
como coadyuvantes en el tratamiento de diversas patologías, incluyendo el cáncer. Además, estos
compuestos pueden ser selectivos y dirigirse solo hacia células tumorales sin ocasionar efectos
secundarios [3]. Estudios epidemiológicos y en animales han demostrado que el consumo de ajo y sus
compuestos de azufrados reducen la incidencia de cáncer de estómago, esófago, colon, mama, piel, útero
y pulmón [4]. Existen numerosas publicaciones que han confirmado la eficacia del ajo para la
prevención y el tratamiento de una variedad de enfermedades validando de esta manera sus usos
tradicionales [5]. El ajo se puede consumir en varias presentaciones, entre ellas como extracto de ajo
envejecido (EAE), esta particular forma de preparación se produce al remojar el ajo en agua o etanol y
sometiéndolo a envejecimiento natural durante un periodo mayor a 10 meses a temperatura ambiente.
pág. 902
Sus constituyentes incluyen compuestos hidrofílicos e hidrofóbicos, tales como S-alilcisteína (SAC), S-
1-propenilcisteína (S1PC), S-alilmercaptocisteína (SAMC), y algunos componentes característicos que
se encuentran en el ajo crudo, como aliina, γ-glutamil-S-alilcisteína (GSAC) y γ-glutamil-S-1-
propenilcisteína (GS1PC), [6]. La s-allil-cisteína (SAC) es el compuesto activo y la molécula más
abundante que se encuentra en el extracto de ajo envejecido y a la que se han atribuido múltiples efectos
benéficos, entre ellos la acción antitumoral [7], también se reconoce su potencial antioxidante por la
eliminación de especies reactivas de oxígeno como anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radical
hidroxilo y anión peroxinitrito. Además, es un componente no tóxico, soluble en agua, estable y
fácilmente absorbido por diversos tejidos, incluido el cerebro [8]. A nivel molecular se ha demostrado
que en algunos tipos de cáncer los compuestos del ajo pueden incrementar p53, este punto es
importanque porque esta proteína es un blanco terapéutico en CaCu; se sabe que en estos tumores p53
es wild type y su vía se encuentra intacta y es completamente funcional. Sin embargo, está enmascarada
por la acción de las oncoproteínas virales, específicamente E6. Visto desde esta perspectiva, el
restablecimiento de los niveles de p53 podría reactivar uno de los puntos de control principales dentro
del ciclo celular, llevando a la célula tumoral a la apoptosis [9]. Aunque los compuestos naturales son
moléculas con gran potencial terapéutico, es necesario hacer el escalamiento de su estudio a modelos in
vivo para evaluar su toxicidad y para evaluar también su potencial como agentes antitumorales. Si bien
muchos agentes probados in vitro parecen promisorios, pocos han sido exitosos en modelos preclínicos
o en pacientes. El modelo más común utilizado para la detección de fármacos con potencial antitumoral
es el modelo de xenoinjerto en ratones inmunosuprimidos que consiste en la introducción de células
tumorales por vía subcutánea [10]. Los modelos de ratón son costosos, delicados y consumen mucho
tiempo en el cuidado y mantenimiento, por lo que se necesita introducir nuevos modelos de los cuales
pág. 903
puedan obtenerse resultados rápidos, y que a su vez puedan contribuir a la identificación de terapias con
el potencial de progresar hacia ensayos preclínicos o ensayos clínicos. La membrana corioalantoidea de
pollo (CAM) se ha utilizado durante muchos años para apoyar el crecimiento de tumores [11]. Ha sido
especialmente atractivo como modelo para estudiar la angiogénesis debido a la accesibilidad y visibilidad
de los vasos sanguíneos en tumores [12]. La capacidad de las células para formar tumores en la CAM
también se ha utilizado para investigar la biología tumoral, la capacidad de las células tumorales para
invadir y hacer metástasis en el embrión y como una plataforma para analizar la eficacia de los fármacos
contra el cáncer [13,14]. El modelo de CAM de Gallus gallus domesticus es un modelo económico, fácil
de utilizar, no se requiere comprar alimento adicional para su mantenimiento y además no requiere un
monitoreo tan frecuente como el modelo de ratón. Conjuntamente, como es un modelo
inmunosuprimido de manera natural puede utilizarse para establecer xenotrasplantes a partir de líneas
celulares tumorales humanas [15]. Este trabajo permitirá sentar las bases en el uso de un modelo in ovo
para el estudio del efecto de compuestos naturales en cáncer cervicouterino, además permitirá hacer una
aproximación al mecanismo molecular, mediante el cual compuestos como el EAE ejercen un efecto
antitumoral. Este trabajo tiene la finalidad de analizar el efecto antitumoral del extracto de ajo envejecido
mediado por el incremento en los niveles de p53 en modelo in vitro; con células HeLa y en tumores
inducidos en la membrana corioalantoidea de embrión de pollo (in ovo). Para validar la funcionalidad
del modelo in ovo como una alternativa para el estudio de la actividad antitumoral de compuestos
naturales
METODOLOGÍA
Diseño experimental: Este trabajo se realizó en el laboratorio de Investigación en Biología del
desarrollo y Teratogénesis Experimental del Hospital Infantil de México Federico Gómez. Por el empleo
de los sujetos de estudio y la captación de la información, este estudio es experimental y prospectivo;
pág. 904
por la medición del fenómeno en el tiempo es transversal; y por la presencia de un grupo de control es
comparativo. Se incluyeron embriones de pollo de 5 días de incubación e inducción efectiva de tumores
en la membrana corioalantoidea (MCA) y cultivos de líneas celulares saludables a una confluencia del
70%. Se excluyeron cultivos contaminados, muestras con bajas concentraciones de proteínas y
embriones de pollo con malformaciones congénitas. Los grupos de estudio fueron los siguientes. Para
el modelo in vitro: 1) células sin tratamiento (grupo control), 2) células tratadas con 5% de EAE, 3)
células tratadas con 10% de EAE, 4) células tratadas con 20% de EAE y 5) células tratadas con 30% de
EAE. Para el modelo in ovo los grupos fueron: 1) tumores sin tratamiento, 2) tumores tratados con 10%
de EAE y 3) tumores tratados con 20% de EAE. En cuanto a las variables, la variable independiente fue
el tratamiento con EAE, y en cuanto a las variables dependientes fueron las siguientes: Viabilidad
celular, niveles de p53 (proteína) y tamaño de los tumores. Se utilizaron líneas celulares provenientes de
CaCu, adquiridas de ATCC y huevos fértiles adquiridos de la granja ALPES Puebla. El extracto de ajo
envejecido fue adquirido con la empresa KYOLIC MX, S. DE R.L. DE C.V.
Cultivo celular: La línea celular HeLa fue cultivada en medio DMEM con 10% de suero fetal bovino
y 1% de una solución de antibiótico antimicótico que contiene 10000 U/ml de penicilina G y 10000
g/ml de estreptomicina y 25g/ml . Se mantuvieron a 37 ºC y a una tensión de CO2 del 5%. Se
sembraron en placas de 6 pozos y después del tratamiento se registraron los camios morfológicos
utilizando un microscopio invertido de campo claro
Ensayo de viabilidad celular: Se realizó el ensayo como se ha descrito previamente [16]. Las células
HeLa se sembraron en placas de 96 pozos a una densidad de 5,000 células por pozo y se trataron con
EAE: 0, 5, 10, 20 y 30 % durante 24 horas. Se realizó el ensayo con Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-
2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) para evaluar la viabilidad celular. Después del tratamiento se preparó
una solución de MTT de 50 mg/ml en medio de cultivo y se agregó 100 μl en cada pozo y las placas se
incubaron a 37 ºC durante 3 horas, pasado este tiempo se retiró el medio y los cristales de formazán se
disolvieron con DMSO, se realizó una lectura a 560 nm.
Western blot: Las células con y sin tratamiento se lisaron en buffer RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5,
150 NaCl mM, Nonidet P-40 al 1,0%, SDS al 0,1%) que contenía inhibidores de proteasa. Las muestras
se prepararon en laemli buffer SDS (Tris-HCl 50 mM, pH 6,8, glicerol al 10%, 4% SDS, azul de
pág. 905
bromofenol al 0,5% y mercaptoetanol al 10%) y posteriormente se separaron 30 µg de proteínas
mediante SDS-PAGE y se transferirán a membranas de nitrocelulosa de 0,45. Las membranas se
incubaron durante la noche a 4 ° C con los anticuerpos primarios anti-p53 (1: 1000) y anti-GAPDH
(1:1000), posteriormente se incubaron con el anticuerpo secundario acoplado a HRP durante 1 hora a
temperatura ambiente. Todos los anticuerpos fueron colocados en TBS- Tween-leche al 6%. Las
proteínas se visualizaron utilizando quimioluminiscencia utilizando una placa autorradiográfica y el
análisis de la densitometría se realizó con el programa Image J.
Inducción de tumores en la membrana corioalantoidea (CAM) de Gallus gallus: Se realizó el ensayo
como se ha descrito previamente [17]. Se obtuvieron huevos de gallina fertilizados de la granja Alpes,
Puebla. Los huevos se incubaron a 38 ° C y 80% de humedad durante los primeros tres días. En el día 4
se abrió una ventana de 1cm2 en el extremo romo del huevo, retirando la cutícula y exponiendo la CAM,
los huevos se sellaron con cinta adhesiva transparente y se incubaron en condiciones estáticas hasta el
día 7, en este día se implantaron en la CAM 4 X 106 células HeLa resuspendidas en 5 µl de matrigel.
Antes de colocar la suspensión celular la CAM se lesionó por laceración con la punta de una pipeta.
Los huevos se volvieron a sellar y después del establecimiento del tumor se les dio tratamiento durante
72 horas.
Inmunohistoquímica: Los tumores se extrajeron del huevo con ayuda de unas pinzas de disección y
fueron fijados en paraformaldehído al 4%, posteriormente se deshidrataron a través de una serie de
alcoholes (30-100%), se sumergieron en xileno y se embebieron en parafina, se realizaron cortes de 5µm
y se montaron en laminillas. Se realizó una incubación con anti p53(1:100) 1 hora a 37 °C, se realizaron
tres lavados de 10 minutos con TBS-tween 20 y se incubaron con anti mouse-HRP (1:200) durante 1
hora a temperatura ambiente. Se utilizó diaminobencidina (DAB) como sustrato
Análisis estadístico: Todos los ensayos fueron realizados por triplicado. Se utilizó el software JAMOVI
para la realización del análisis estadístico y la elaboración de las gráficas. Se realizó la prueba de
Kruskall Wallis seguida de la prueba de Dunn. Los datos se representan como media + DE (desviación
estándar), una p< 0.05 se tomó como estadísticamente significativa.
pág. 906
RESULTADOS
Cambios morfológicos sugerentes de muerte celular
Para demostrar el efecto del EAE en la morfología de células HeLa se realizaron tratamientos a cultivos
celulares al 70% de confluencia, demostrando que el EAE induce cambios morfológicos sugerentes de
muerte celular. Las células pierden comunicación entre sí, se desprenden del soporte y se forman cuerpos
apoptóticos señalados con flechas (Figura 1 A). Se realizó además un ensayo de viabilidad celular con
MTT demostrando que el tratamiento con EAE induce una disminución significativa en la viabilidad
celular de una manera dosis dependiente (Figura 1 B). Se realizó el análisis de los niveles de p53
mediante western blot, observando que el tratamiento con EAE incrementa los niveles de p53. La dosis
de 20% es la que ocasiono un incremento mayor en los niveles de p53 (Figura 1C).
Figura 1. Tratamiento de células HeLa en cultivo. A) Cambios morfológicos en las células tratadas, las
flechas indican los cuerpos apoptóticos. B). Ensayo de viabilidad celular con MTT, C) Western blot de
los niveles de p53 junto con su análisis densitométrico. Todos los grupos experimentales se compararon
con el grupo control, los datos son representados con media + DE. Los asteriscos indican significancia
estadística: ** p<0.01 *** p<0.001
pág. 907
Inducción de tumores in ovo
Se realizó el establecimiento de tumores en la CAM del embrión de pollo, los huevos fertilizados de
pollo se colocan en una incubadora con rotación automática. En el cuarto día de incubación se ha
formado la CAM y los huevos se retiran de la incubadora y se desinfectan utilizando gasas rociadas con
alcohol al 70%. se retiran suavemente pequeñas secciones de la cáscara del huevo desde el extremo romo
utilizando pinzas de disección. Esto se hace para crear una ventana (~1 cm²) en la cáscara del huevo para
exponer la membrana testácea externa. Esta membrana se sopla suavemente utilizando un bulbo de
pipeta de Pasteur
(para evitar que pequeños fragmentos de cáscara caigan en la cámara de aire) y se
retira. Esto expone la membrana testácea interna que se encuentra al fondo de la cámara de aire; esta
membrana debe retirarse con mucho cuidado para no dañar la vasculatura, exponiendo así la CAM para
la inoculación de células tumorales. Finalmente, la ventana se sella con cinta transparente y el huevo se
coloca en una incubadora estática a 37.5 ◦C con humedad constante (85%). El esquema general del
procedimiento se esquematiza en la figura 2 A-C.
pág. 908
Figura 2. Estrategia general para la inducción de tumores in ovo. Se realizó la inducción de tumores para
evaluar el efecto antitumoral del EAE. A) Se indican los días durante los cuales el embrión de pollo se
desarrolla, B) 1-6 Se inicia incubando los huevos en movimiento constante, se retira el cascarón y las
membranas testáceas, se expone la CAM y se inoculan las células tumorales. C) Una vez desarrollado el
tumor, se retira del huevo y se procesa para análisis posteriores.
Tratamiento de tumores con EAE
Los tumores inducidos in ovo se trataron con EAE durante 72 horas (Figura 3 A-C). Después del
tratamiento se realizó la medición del eje mayor de los tumores, el tratamiento disminuye el tamaño de
los tumores en un 25% (dosis de 10%) y en un 50% (dosis de 20%). Indicando el efecto antitumoral del
extracto estudiado.
pág. 909
Figura 3. Tratamiento de los tumores inducidos en el modelo in ovo. A partir de la línea celular HeLa
se indujeron tumores en la membrana corioalantoidea (CAM) de embrión de pollo, después del
tratamiento de los tumores con EAE por 72 horas se observó una disminución en el tamaño de estos. Las
flechas señalan los tumores dentro del huevo. A) Tumor sin tratamiento, B) Tumor tratado con EAE
10%, C) Tumor tratado con EAE 20%, D) Análisis del eje mayor. Los grupos experimentales se
compararon con el grupo control, los datos son representados con media + DE. Los asteriscos indican
significancia estadística: * p<0.05 ** p<0.01
Inmnodetección de p53 en tumores inducidos in ovo tratados con EAE
Para comprobar el hallazgo in vitro en donde se observa un incremento en los niveles de p53, se midió
por inmunohistoquímica p53 en secciones de los tumores inducidos in ovo, se observa que existe un
incremento en la expresión de este marcador en tejido tratado comparado con el tejido sin tratamiento
(Figura 4)
pág. 910
Figura 4. Expresión de p53 en tumores inducidos in ovo tratados con EAE. Secciones de tumores
en los que se realizó la inmunodetección de p53 (+). A) Tumor sin tratamiento, B) tumor tratado con
10% de EAE ( ++), C) tumor tratado con 20% de EAE (+++).
DISCUSIÓN
El presente estudio proporciona evidencia sobre el efecto del extracto de ajo envejecido en la viabilidad
de células HeLa, un modelo ampliamente utilizado para estudiar el cáncer cervical, así como en tumores
inducidos in ovo (en la membrana corioalantoidea de embrión de pollo). Los resultados muestran que el
extracto de ajo envejecido disminuye significativamente la viabilidad celular de las células HeLa en
cultivo de una manera dosis-dependiente. Estos resultados están relacionados con estudios previos que
han demostrado que el ajo y sus derivados, como el S- alilcisteína, poseen propiedades antitumorales
debido a sus efectos antioxidantes, antiinflamatorios y de modulación de la apoptosis mediada por p53
[18, 19]. Se sabe que los compuestos sulfurados presentes en el ajo envejecido, como el S-alilcisteína,
tienen propiedades que pueden modificar la actividad de diversas quinasas, inhibir la proliferación
celular y favorecer la muerte celular programada [7].
p53 es considerado el guardián del genoma porque previene la transformación celular [20]. Aunque p53
está mutado en la mayoría de los cánceres, en el caso del cáncer cervical se conserva p53 de tipo silvestre
y funcional [21]. Por lo tanto, si incrementa se pueden reactivar las vías de apoptosis [22]. La restauración
de p53 puede ser una estrategia terapéutica prometedora. En este contexto, el ajo envejecido podría actuar
como un agente quimioterapéutico natural, complementando o potenciando los tratamientos
convencionales en la lucha contra el cáncer. El modelo in ovo utilizado en este estudio representa un
avance significativo para la investigación de tratamientos anticancerígenos. La utilización del embrión
de pollo como modelo para estudiar el crecimiento tumoral ofrece una serie de ventajas, como la
observación directa de los efectos del tratamiento sobre el tumor. En este modelo, los tumores tratados
pág. 911
con extracto de ajo envejecido mostraron una disminución en el tamaño tumoral y un incremento en los
niveles de p53, lo que sugiere que el extracto no solo afecta la viabilidad celular, sino que también
interfiere con la tumorigénesis [13]. Este hallazgo es consistente con estudios anteriores que han
indicado que el ajo y sus compuestos pueden inhibir el crecimiento de los tumores [23]. Además, el
hecho de que el extracto de ajo envejecido haya mostrado eficacia tanto in vitro como in vivo demuestra
su potencial como un agente coadyuvante terapéutico. Estos resultados refuerzan la idea de que los
extractos naturales podrían jugar un papel importante en la medicina oncológica moderna,
complementando las terapias convencionales y ofreciendo un enfoque menos tóxico en comparación
con la quimioterapia convencional.
CONCLUSIONES
Este estudio destaca el potencial del extracto de ajo envejecido como un agente anticancerígeno, que
podría tener aplicaciones tanto en la inhibición de la viabilidad celular como en la prevención de la
progresión tumoral. Se justifica la realización de más investigaciones para explorar su aplicación en
terapias complementarias y alternativas en el tratamiento del cáncer. Aunque los resultados obtenidos
son prometedores, es importante señalar algunas limitaciones del estudio. En primer lugar, se debe
realizar una mayor investigación sobre los mecanismos moleculares específicos a través de los cuales el
ajo envejecido ejerce sus efectos antitumorales. El uso de modelos adicionales de cáncer y la evaluación
de la toxicidad a largo plazo del extracto en modelos animales más complejos, también son cruciales
para determinar la seguridad y la eficacia clínica de este tratamiento. Además, la variabilidad en la
composición química del ajo envejecido según el proceso de preparación podría influir en los resultados,
lo que sugiere que futuros estudios deberían estandarizar la preparación del extracto para garantizar su
reproducibilidad.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Johnson, C. A., James, D., Marzan, A., & Armaos, M. (2019). Cervical cancer: An overview of
pathophysiology and management. Seminars in Oncology Nursing, 35(2), 166–174.
https://doi.org/10.1016/j.soncn.2019.02.003
pág. 912
2. Yadav, G., Srinivasan, G., & Jain, A. (2024). Cervical cancer: Novel treatment strategies offer
renewed optimism. Pathology - Research and Practice, 254, 155136.
https://doi.org/10.1016/j.prp.2024.155136
3. Sauter, E. R. (2020). Cancer prevention and treatment using combination therapy with natural
compounds. Expert Review of Clinical Pharmacology, 13(3), 265–285.
https://doi.org/10.1080/17512433.2020.1738218
4. De Greef, D., Barton, E. M., Sandberg, E. N., Croley, C. R., Pumarol, J., Wong, T. L., Das, N.,
& Bishayee, A. (2021). Anticancer potential of garlic and its bioactive constituents: A
systematic and comprehensive review. Seminars in Cancer Biology, 73, 219–264.
https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2020.11.020
5. Rana, S. V., Pal, R., Vaiphei, K., Sharma, S. K., & Ola, R. P. (2011). Garlic in health and
disease. Nutrition Research Reviews, 24(1), 60–71.
https://doi.org/10.1017/S0954422410000338
6. Kodera, Y., Kurita, M., Nakamoto, M., & Matsutomo, T. (2020). Chemistry of aged garlic:
Diversity of constituents in aged garlic extract and their production mechanisms via the
combination of chemical and enzymatic reactions. Experimental and Therapeutic Medicine,
19(2), 1574–1584. https://doi.org/10.3892/etm.2019.8393
7. Agbana, Y. L., Ni, Y., Zhou, M., Zhang, Q., Kassegne, K., Karou, S. D., Kuang, Y., & Zhu, Y.
(2020). Garlic-derived bioactive compound S-allylcysteine inhibits cancer progression through
diverse molecular mechanisms. Nutrition Research, 73, 1–14.
https://doi.org/10.1016/j.nutres.2019.11.002
8. Colín-González, A. L., Sánchez-González, M., Pérez-Vázquez, V., et al. (2012). The
antioxidant mechanisms underlying the aged garlic extract- and S-allylcysteine-induced
protection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2012, 1–16.
https://doi.org/10.1155/2012/907162
9. Zhao, X., Sun, W., Ren, Y., & Lu, Z. (2021). Therapeutic potential of p53 reactivation in
cervical cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 157, 103182.
https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2020.103182
pág. 913
10. Swadi, R., Mather, G., Pizer, B. L., Losty, P. D., See, V., & Moss, D. (2018). Optimising the
chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC
Cancer, 18(1), 28. https://doi.org/10.1186/s12885-017-3978-x
11. Ribatti, D. (2008). The chick embryo chorioallantoic membrane in the study of tumor
angiogenesis. Romanian Journal of Morphology and Embryology, 49(2), 131–135.
12. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., & Dammacco, F. (1997). New model for the study
of angiogenesis and antiangiogenesis in the chick embryo chorioallantoic membrane: The
gelatin sponge/chorioallantoic membrane assay. Journal of Vascular Research, 34(6), 455–463.
13. Cimpean, A. M., Ribatti, D., & Raica, M. (2008). The chick embryo chorioallantoic membrane
as a model to study tumor metastasis. Angiogenesis, 11(4), 311–319.
https://doi.org/10.1007/s10456-008-9117-1
14. Mani, S., Swargiary, G., & Singh, K. K. (2020). Natural agents targeting mitochondria in cancer.
International Journal of Molecular Sciences, 21(19), 6992.
https://doi.org/10.3390/ijms21196992
15. Schneider-Stock, R., & Ribatti, D. (2021). The CAM assay as an alternative in vivo model for
drug testing. In Handbook of Experimental Pharmacology (Vol. 265, pp. 303–323). Springer.
https://doi.org/10.1007/164_2020_375
16. Kumar, P., Nagarajan, A., & Uchil, P. D. (2018). Analysis of cell viability by the MTT assay.
Cold Spring Harbor Protocols, 2018(6), pdb.prot095505.
https://doi.org/10.1101/pdb.prot095505
17. Patiño-Morales, C. C., Jaime-Cruz, R., Ramírez-Fuentes, T. C., Villavicencio-Guzmán, L., &
Salazar-García, M. (2023). Technical implications of the chicken embryo chorioallantoic
membrane assay to elucidate neuroblastoma biology. International Journal of Molecular
Sciences, 24(19), 14744. https://doi.org/10.3390/ijms241914744
18. Nicastro, H. L., Ross, S. A., & Milner, J. A. (2015). Garlic and onions: Their cancer prevention
properties. Cancer Prevention Research, 8(3), 181–189. https://doi.org/10.1158/1940-
6207.CAPR-14-0172
pág. 914
19. Kawasaki, H., & Nussbaum, G. (2025). Therapeutic potential of garlic, aged garlic extract and
garlic-derived compounds on pancreatic cancer (Review). Biomedical Reports, 22(3), 54.
https://doi.org/10.3892/br.2025.1932
20. Lavin, M. F., & Gueven, N. (2006). The complexity of p53 stabilization and activation. Cell
Death & Differentiation, 13(6), 941–950. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4401925
21. Srivastava, S., Tong, Y. A., Devadas, K., Zou, Z. Q., Chen, Y., Pirollo, K. F., & Chang, E. H.
(1992). The status of the p53 gene in human papillomavirus positive or negative cervical
carcinoma cell lines. Carcinogenesis, 13(7), 1273–1275.
https://doi.org/10.1093/carcin/13.7.1273
22. Goodwin, E. C., & DiMaio, D. (2000). Repression of human papillomavirus oncogenes in HeLa
cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(23), 12513–12518.
https://doi.org/10.1073/pnas.97.23.12513
23. Farhat, Z., Hershberger, P. A., Freudenheim, J. L., Mammen, M. J., Hageman Blair, R., Aga, D.
S., & Mu, L. (2021). Types of garlic and their anticancer and antioxidant activity: A review of
the epidemiologic and experimental evidence. European Journal of Nutrition, 60(7), 3585–
3609. https://doi.org/10.1007/s00394-021-02482-7
