Evaluaci�n in vitro de inhibidores
contra hongos
micotoxig�nicos del ma�z
Marco Maidana-Ojeda
Universidad Aut�noma Chapingo
Chapingo,
M�xico
Marcelo
Acosta-Ramos
Universidad Aut�noma Chapingo
Chapingo,
M�xico
Mar�a
Graciela-Cabrera
Universidad Nacional del Nordeste
Corrientes,
Argentina
Lidia Quintana-Viedma
Universidad
Nacional de Itap�a
Encarnaci�n,
Paraguay
Guillermo Enciso-Maldonado
Centro
de Desarrollo e Innovaci�n Tecnol�gica
Hohenau,
Paraguay
Yerut�
Mongel�s-Franco
Centro
de Desarrollo e Innovaci�n Tecnol�gica
Hohenau, Paraguay
RESUMEN
Los
inhibidores f�ngicos son alternativas para el manejo de hongos micotoxig�nicos, como Aspergillus sp. y Fusarium sp. El
objetivo del trabajo fue evaluar el efecto in vitro del extracto de Larrea tridentata 95%, azadiractina
85% y la mezcla de �cido asc�rbico 1% + �cido c�trico 0,25% + �cido l�ctico
0,25%, sobre Aspergillus flavus, A. fumigatus y Fusarium verticillioides.
Se aplic� un dise�o experimental completamente al azar, donde los tratamientos
fueron concentraciones de 0, 1; 10; 100; 1.000 y 10.000 ppm de los inhibidores
extracto de Larrea tridentata 95% y azadiractina 85%, y concentraciones de 0; 1; 10; 100 y
1.000 del inhibidor conformado por la mezcla de �cidos, cada experimento con 4
repeticiones, y se determin� el crecimiento radial e inhibici�n micelial. La mezcla de �cido asc�rbico 1% + �cido c�trico
0,25% + �cido l�ctico 0,25% a 1.000 ppm inhibi� el 100% el crecimiento de, A.
flavus, A. fumigatus
y F. verticillioides, mientras el extracto de Larrea
tridentata 95% y azadiractina
85% produjeron la mayor inhibici�n en A. fumigatus,
con 74% y 54%, respectivamente, en la concentraci�n de 10.000 ppm. El extracto
de Larrea tridentata 95% ocasion� un 45% de
inhibici�n micelial en A. flavus
y 61% en F. verticillioides.
Palabras clave: inhibidores; hongos micotoxig�nicos; aspergillus
flavus; aspergillus
fumigatus; fusarium verticillioides.
In vitro evaluation of inhibitors against mycotoxigenic
fungi of corn
ABSTRACT
Fungal inhibitors
are alternatives for the management of mycotoxigenic
fungi, such as Aspergillus sp. and Fusarium
sp. The objective of this study was to evaluate the in vitro effect of
the Larrea tridentata
95% extract, azadirachtin 85% and the mixture of
ascorbic acid 1% + citric acid 0.25% + lactic acid 0.25%, on Aspergillus flavus, A. fumigatus
and Fusarium verticillioides.
A completely randomized experimental design was applied, where the treatments
were concentrations of 0.1; 10; 100; 1,000 and 10,000 ppm of the inhibitors Larrea tridentata
95% extract and azadirachtin 85%, and concentrations
of 0; 1; 10; 100 and 1,000 of the inhibitor formed by the mixture of acids,
each experiment with 4 repetitions, the radial growth and mycelial inhibition
were determined. The mixture of 1% ascorbic acid + 0.25% citric acid + 0.25%
lactic acid at 1,000 ppm inhibited 100% growth of A. flavus,
A. fumigatus and F. verticillioides,
while the Larrea tridentata
95% extract and azadirachtin 85% produced the highest
inhibition in A. fumigatus, with 74% and 54%,
respectively, at the 10,000 ppm concentration. The 95% Larrea
tridentata extract caused 45% mycelial inhibition
in A. flavus and 61% in F. verticillioides.
Keywords: fungal inhibitors; mycotoxigenic
fungi; aspergillus flavus,
aspergillus fumigatus;
fusarium verticillioides.
Art�culo
recibido:� 03 marzo 2022
Aceptado para
publicaci�n: 20 marzo 2022
Correspondencia: [email protected]
Conflictos de Inter�s: Ninguna que declarar
Las micotoxinas
son metabolitos f�ngicos primarios y secundarios que poseen efectos
inmunosupresores, carcinog�nicos, mutag�nicos y teratog�nicos, y se caracterizan por presentar una acci�n
r�pida de intoxicaci�n y una acci�n lenta de cancerizaci�n (Caba�ez
2000). La presencia de micotoxinas en los vegetales
puede deberse a varios factores, como la infecci�n de la planta en el campo por
hongos fitopat�genos, la colonizaci�n y crecimiento
por hongos sapr�fitos, pat�genos de postcosecha sobre
frutos o granos almacenados, o el desarrollo f�ngico de los sapr�fitos durante
el almacenamiento de productos procesados (Bennett y Klich
2003; Chulze 2010).
En la producci�n de micotoxinas se destacan tres g�neros f�ngicos, que pueden ser
asociados con micotoxinas espec�ficas. Los
respectivos g�neros f�ngicos y micotoxinas son: Aspergillus,
que com�nmente produce aflatoxinas del tipo B1, M1 y
G1, sterigmatocistina y ocratoxina
A; Fusarium, importante productor de fumonisinas,
zearalenona, tricotecenos (deoxynivalenol, toxina T2 y DAS), fusarina
y moniliformina; y Penicillium,
que se destaca como sintetizador de patulina, citrina
y ocratoxina (Ara�jo 2012; Munkvold 2003). Las especies del g�nero Aspergillus
m�s importantes como productoras de aflatoxinas son
los de la secci�n Flavi, que incluyen a A. flavus, A. parasiticus y varias otras especies (Bennett y Klich 2003; Richard 2007), mientras que las especies de Fusarium
m�s importantes como micotoxig�nicas son F. verticillioides, F. proliferatum
y F. graminearum, los cuales b�sicamente
producen fumonisina, deoxynivalenol
y otras sustancias de importancia secundaria (Sephard
et al. 1996).
Para producir micotoxinas,
controlando el tipo y las cantidades, es necesario primero obtener una alta
sanidad del cultivo, y posteriormente controlar adecuadamente las principales
variables del almacenamiento. Estos factores no act�an por separado, y el grado
de la invasi�n f�ngica depender� de una interacci�n entre los mismos (Binder 2007). Como alternativas de manejo se utilizan los
siguientes m�todos: f�sico (Binder 2007), biol�gico,
t�rmico, irradiaci�n, absorbentes (Jouany 2007), y el
empleo de compuestos secuestrantes o detoxificantes (Arroyo-Manzanares et al. 2014), as� como
los de atmosferas controladas, conservantes o inhibidores naturales (Chulze 2010).
En el manejo de la problem�tica
generada por hongos en los productos agr�colas, los inhibidores f�ngicos son
derivados de diferentes fuentes, como el �cido transcin�mico
y el �cido fer�lico, solos o en mezcla (Nesci et al. 2007), quitosano (Cota-Arriola
et al. 2011), propionatos de amonio, de calcio y de
sodio (Moreno-Mart�nez et al. 2000), y m�s de 280 extractos vegetales de
diferentes especies de plantas, de las cuales aproximadamente 100 poseen alg�n
efecto sobre el crecimiento o producci�n de micotoxinas
(Montes-Belmont y Carvajal 1998).
Los extractos de Neem
Azadirachta indica (azadiractina)
y Larrea tridentata, y los �cidos asc�rbico,
c�trico y l�ctico, son inhibidores f�ngicos que presentan efectividad variable
ante algunas especies de Aspergillus y Fusarium (Allameh et al. 2002; Moreno-Lim�n et al. 2011;
Su�rez-Gim�nez et al. 2007; Tequida-Menezes et al.
2002), y requieren mayores estudios de sus efectos inhibitorios sobre hongos micotoxig�nicos, considerando que estos productos est�n
disponibles comercialmente pero indicados para otros problemas fitosanitarios.
Teniendo en cuenta los aspectos
mencionados, se plante� como objetivo de esta investigaci�n evaluar el efecto in
vitro de los inhibidores extracto de Larrea tridentata
95%; azadiractina 85%; y la mezcla de �cido asc�rbico
1% + �cido c�trico 0,25% + �cido l�ctico 0,25%, sobre los hongos micotoxig�nicos Aspergillus flavus,
Aspergillus fumigatus y Fusarium verticillioides.
Los trabajos se llevaron a cabo en el
Laboratorio de Fitopatolog�a de la Universidad Aut�noma de Chapingo, ubicado en
el km 38,5 de la carretera M�xico - Texcoco, Chapingo, Estado de M�xico. El
periodo de ejecuci�n del estudio fue entre los meses de mayo y setiembre de
2015.
Las unidades experimentales fueron
placas Petri de 9 cm de di�metro con 20 ml de medio de cultivo papa-dextrosa-agar
(PDA), dispuestas en un dise�o experimental completamente al azar, con 4
repeticiones. El mismo experimento fue realizado en dos r�plicas para cada
inhibidor y cada especie de hongo evaluado.
Los tratamientos consistieron en
concentraciones de 0; 1; 10; 100; 1.000 y 10.000 ppm de los inhibidores
extracto de Larrea tridentata 95% y azadiractina 85%, y concentraciones de 0; 1; 10; 100 y 1.000
del inhibidor conformado por la mezcla de �cido asc�rbico 1% + �cido c�trico 0,25%
+ �cido l�ctico 0,25%. Los inhibidores se aplicaron agregando las diluciones
requeridas de cada uno de los extractos en el medio de cultivo PDA, para
obtener las respectivas concentraciones, que inmediatamente se vertieron en las
placas Petri (Guerrero-Rodr�guez et al. 2007), y se dej� solidificar durante 24
horas. Posteriormente, las placas se inocularon colocando en el centro un disco
de 0,4 cm de di�metro de colonia cultivada de la cepa a evaluar. Las tres
especies de hongos utilizados en el experimento fueron Aspergillus flavus, A. fumigatus y
Fusarium verticillioides. Cada experimento
tuvo una duraci�n de seis d�as para el desarrollo micelial.
Las variables evaluadas fueron el crecimiento
radial cada 48 horas, para lo cual se traz� una l�nea diametral por el centro
de la colonia y se midi� el crecimiento radial en sentido de la l�nea, con una
regla graduada en cent�metros; y el crecimiento micelial
relativo al testigo absoluto, constituido por el porcentaje de crecimiento micelial en relaci�n al testigo absoluto, considerado como
el 100% de crecimiento.
Los resultados se sometieron a un el
an�lisis de varianza (ANAVA) y una prueba de comparaci�n m�ltiple de medias de Tukey (α=0.05). Debido a que los resultados de las dos
r�plicas del experimento en un primer an�lisis resultaron similares
estad�sticamente, se concaten� en un solo experimento para el an�lisis de
varianza final. Se utiliz� el software de an�lisis estad�stico SAS versi�n 9.3.
En las tablas 1 y 2 se presentan los
resultados correspondientes al crecimiento radial y crecimiento micelial relativo al testigo absoluto, respectivamente, de A.
flavus, con diferentes concentraciones de
inhibidores, a los seis d�as de la inoculaci�n. Se observaron diferencias
estad�sticas altamente significativas para los tres inhibidores utilizados.
Tabla 1. Crecimiento radial del micelio (cm) de A. flavus,
con diferentes concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
Concentraci�n (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
0 |
0,54 |
b |
0,49 |
ab |
0,49 |
b |
1 |
0,49 |
b |
0,64 |
bc |
0,54 |
b |
10 |
0,46 |
b |
0,72 |
c |
0,5 |
b |
100 |
0,44 |
b |
0,58 |
abc |
0,14 |
a |
1.000 |
0,43 |
ab |
0,43 |
a |
0 |
a |
10.000 |
0,26 |
a |
0,43 |
a |
- |
|
CV (%) |
28,86 |
23,24 |
23,69 |
|||
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
Para la mezcla de �cido asc�rbico 1%
+ �cido c�trico 0,25% + �cido l�ctico 0,25%, se observ� que la concentraci�n de
1.000 ppm inhibi� al 100% el crecimiento micelial del
hongo, y se registr� un leve crecimiento en la concentraci�n de 100 ppm (27%
crecimiento micelial relativo al testigo absoluto);
estas dos concentraciones se diferenciaron significativamente de los dem�s
tratamientos con menor concentraci�n, las cuales no causaron inhibici�n y
resultaron estad�sticamente similares al tratamiento control (0 ppm). As�
tambi�n, para el tratamiento con azadiractina 85%,
los valores m�s bajos de crecimiento micelial fueron
registrados en concentraciones de 1.000 y 10.000 ppm, con promedios similares y
un crecimiento micelial relativo al testigo absoluto
de 94% y 91%, respectivamente (Tabla 2). Este resultado fue similar a lo
observado por Ghorbanian et al., (2008) y Bhatnagar y McCormick (1988), con
A. parasiticus.
Tabla 2.
Crecimiento micelial relativo al testigo (%) del
micelio de A. flavus, con diferentes
concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
Concentraci�n (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
0 |
100 |
b |
100 |
ab |
100 |
b |
1 |
115 |
b |
134 |
ab |
113 |
b |
10 |
95 |
ab |
152 |
ab |
107 |
b |
100 |
94 |
ab |
121 |
ab |
27 |
a |
1.000 |
92 |
ab |
91 |
a |
0 |
a |
10.000 |
55 |
a |
94 |
a |
- |
|
CV (%) |
27,4 |
30,98 |
35,15 |
|||
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
Sin embargo, el crecimiento micelial fue mayor en las concentraciones de 1, 10 y 100
ppm, inclusive con promedios superiores al testigo, evidenciando que, de
acuerdo a la variaci�n de concentraci�n, podr�a presentarse un efecto
contradictorio y estimulante de este producto para el crecimiento micelial de A. flavus.
Resultados similares fueron obtenidos por Da Costa et al. (2010) y Allameh et al. (2002), en concentraciones de 5.000 y 50.000
ppm de inhibidor, quienes no observaron efecto del aceite esencial de neem sobre el crecimiento micelial,
pero, sin embargo, comprobaron que se produce una reducci�n en la producci�n de
aflatoxinas.
Por otro lado, se observ� que en el
tratamiento con extracto de Larrea tridentata
95%, en la concentraci�n 10.000 ppm, el crecimiento micelial
relativo al testigo absoluto fue de 55% (Tabla 2), claramente superior al
crecimiento en las concentraciones menores, entre las cuales no se observ�
diferencias significativas, y no se registr� un crecimiento micelial
relativo al testigo absoluto menor al 90%.
En las tablas 3 y 4 se presentan los
resultados correspondientes al crecimiento radial en cent�metros de micelio y
crecimiento micelial relativo al testigo absoluto de A.
fumigatus, bajo la acci�n de diferentes
concentraciones de inhibidores, a los 6 d�as de inoculaci�n. En este ensayo se
observaron diferencias estad�sticas altamente significativas para los 3
inhibidores utilizados.
Tabla 3.
Crecimiento radial del micelio (cm) de A. fumigatus,
con diferentes concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
Concentraci�n (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
0 |
1,38 |
b |
1,40 |
b |
1,41 |
c |
1 |
1,35 |
b |
1,56 |
b |
1,39 |
c |
10 |
1,14 |
b |
1,55 |
b |
1,28 |
c |
100 |
1,11 |
b |
1,43 |
b |
1,04 |
b |
1.000 |
1,11 |
b |
0,72 |
a |
0 |
a |
10.000 |
0,35 |
a |
0,49 |
a |
- |
|
CV (%) |
20 |
12,25 |
15,48 |
|||
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
La mezcla de �cido asc�rbico 1% +
�cido c�trico 0,25% + �cido l�ctico 0,25% result� muy eficiente como inhibidor
de crecimiento micelial en concentraciones muy bajas
para ambas especies de Aspergillus, incluso a concentraciones menores de
lo permitido para conservaci�n de productos alimenticios, estimado en un rango
de 1 a 6% (Ribotta y Tadini
2009), lo cual refleja el efecto sin�rgico de la mezcla de estos �cidos (Tabla
3). La mezcla de �cido asc�rbico 1% + �cido c�trico 0,25% + �cido l�ctico 0,25%
a 1.000 ppm inhibi� completamente el crecimiento de A. fumigatus,
mientras que en las concentraciones menores se observaron crecimientos
considerables, con valores relativos al testigo absoluto de 75% a 100 ppm, y
mayor al 90% a 10 ppm, resultados estad�sticamente similares al tratamiento con
1 ppm y el control (Tabla 4) En cuanto al empleo de azadiractina
85%, no hubo diferencias significativas entre los tratamientos con 1.000 y
10.000 ppm, tratamiento que inhibieron el crecimiento micelial
en un 52 y 54%, respectivamente, con un rango de crecimiento radial del micelio
de 1,40 y 1,56 cm.
Tabla 4.
Crecimiento micelial relativo al testigo (%) del
micelio de A. fumigatus, con diferentes
concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
Concentraci�n (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
0 |
100 |
b |
93 |
b |
100 |
c |
1 |
100 |
b |
105 |
b |
100 |
c |
10 |
85 |
b |
105 |
b |
91 |
c |
100 |
81 |
b |
97 |
b |
75 |
b |
1.000 |
82 |
b |
48 |
a |
0 |
a |
10.000 |
26 |
a |
46 |
a |
- |
|
CV (%) |
25,17 |
18,4 |
12,84 |
|||
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
El extracto de Larrea tridentata al 95%, tuvo su mayor eficacia en la
concentraci�n de 10.000 ppm, dosis en la cual se registr� un crecimiento micelial de 0,35 cm (crecimiento micelial
de 26%), diferenci�ndose de los valores registrados en las dem�s
concentraciones, que superaron el 80% de crecimiento micelial
relativo al testigo absoluto, y fueron estad�sticamente similares al
tratamiento control (Tabla 4).
En las tablas 5 y 6 se presentan los
resultados correspondientes al crecimiento radial del micelio en cent�metros y
el crecimiento micelial relativo al testigo absoluto
de F. verticillioides, con diferentes
concentraciones de inhibidores, a los 6 d�as de inoculaci�n. Similar con lo
observado en A. flavus y A. fumigatus, las diferencias registradas resultaron
altamente significativas para los 3 inhibidores utilizados.
Tabla 5.
Crecimiento radial del micelio (cm) de F. verticillioides,
con diferentes concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
Concentraci�n (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
0 |
0,88 |
��� c |
0,88 |
a |
0,88 |
� bc |
1 |
0,81 |
� bc |
1,9 |
� d |
1,19 |
����� d |
10 |
0,66 |
� b |
2,04 |
� d |
1,02 |
��� cd |
100 |
0,98 |
��� c |
1,68 |
��� c |
0,7 |
� b |
1.000 |
1,51 |
����� d |
1,21 |
� b |
0 |
a |
10.000 |
0,34 |
a |
1,04 |
a |
- |
|
CV (%) |
13,72 |
7,51 |
16,25 |
|||
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
Como lo ocurrido con A. flavus y A. fumigatus,
la concentraci�n de 1.000 ppm, de �cido asc�rbico 1% + �cido c�trico 0,25% +
�cido l�ctico 0,25% inhibi� en un 100% el crecimiento de F. verticillioides, en contraste con el tratamiento de 100
ppm, en el cual el crecimiento micelial relativo al
testigo absoluto fue del 80%, inclusive observ�ndose una clara estimulaci�n en
el crecimiento (superiores al 100%) en concentraciones menores (Tablas 5 y 6).
Para azadractina
85%, no hubo inhibici�n del crecimiento de F. verticillioides,
al contrario, se observ� una estimulaci�n del crecimiento (superiores al 100%),
misma tendencia observada en A. flavus cuando
las concentraciones del producto eran menores a 1.000 ppm. Moslem
y El-Kholie (2009), comprobaron efectos inhibitorios
del extracto de neem en F. oxysporum,
al igual que Joseph et al. (2008) en F. solani,
pero cuando las concentraciones fueron superiores a 50.000 ppm; mientras que
Geraldo et al. (2010) observaron un 35% de inhibici�n del crecimiento de F. oxysporum y F. subglutinans
sometidos a 10.000 ppm de extracto de neem.
Tabla 4.
Crecimiento micelial relativo al testigo (%) del
micelio de F. verticillioides, con diferentes
concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
Concentraci�n (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
0 |
100 |
c |
100 |
ab |
100 |
bc |
1 |
93 |
bc |
219 |
b |
138 |
d |
10 |
77 |
b |
237 |
c |
118 |
cd |
100 |
113 |
c |
195 |
d |
80 |
b |
1.000 |
174 |
d |
139 |
cd |
0 |
a |
10.000 |
39 |
a |
120 |
a |
- |
|
CV (%) |
15,13 |
12,38 |
19,03 |
|||
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
El extracto de Larrea tridentata 95% por su parte, de modo similar a lo
ocurrido en A. fumigatus, inhibi� el
crecimiento de F. verticillioides en la
concentraci�n 10.000 ppm, alcanzando hasta un porcentaje de 39% de crecimiento
relativo al testigo absoluto (Tabla 6). Mayores efectos inhibitorios se
consiguieron con los extractos de Larrea tridentata
95%, en las especies de Aspergillus y Fusarium evaluados, sin
embargo, se requiere una mayor concentraci�n del extracto (Moreno-Lim�n et al.
2011; Su�rez-Gim�nez et al. 2007; Tequida-Menezes et
al. 2002), el uso de sus constituyentes antif�ngicos
(methyl-NDGA) en forma pura (Vargas-Arispuroa et al. 2005), o mezclas con otros inhibidores (Reyes-Mungu�a
et al. 2014). En estos casos, cuando el objetivo es el desarrollo del producto
para aplicaci�n en materias primas para productos alimenticios, las
concentraciones m�s elevadas o las mezclas de las mismas, deben realizarse sin
comprometer la inocuidad (Stanley et al. 2007).
La concentraci�n de 1,000 ppm �cido
asc�rbico 1% + �cido c�trico 0,25% + �cido l�ctico 0,25% inhibi� el 100% el
crecimiento de A. flavus, A. fumigatus y F. verticillioides.
La mayor efecto inhibitorio del extracto de Larrea tridentata 95% y azadiractina
85% se registr� en A. fumigatus, con 74% y 54%,
respectivamente, en la concentraci�n de 10.000 ppm. El extracto de Larrea tridentata 95% ocasion� un 45% de inhibici�n del
crecimiento micelial en A. flavus
y 61% en F. verticillioides.
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