Evaluación in vitro de inhibidores
contra hongos
micotoxigénicos del maíz
Marco Maidana-Ojeda
Universidad Autónoma Chapingo
Chapingo,
México
Marcelo
Acosta-Ramos
Universidad Autónoma Chapingo
Chapingo,
México
María
Graciela-Cabrera
Universidad Nacional del Nordeste
Corrientes,
Argentina
Lidia Quintana-Viedma
Universidad
Nacional de Itapúa
Encarnación,
Paraguay
Guillermo Enciso-Maldonado
Centro
de Desarrollo e Innovación Tecnológica
Hohenau,
Paraguay
Yerutí
Mongelós-Franco
Centro
de Desarrollo e Innovación Tecnológica
Hohenau, Paraguay
RESUMEN
Los
inhibidores fúngicos son alternativas para el manejo de hongos micotoxigénicos, como Aspergillus sp. y Fusarium sp. El
objetivo del trabajo fue evaluar el efecto in vitro del extracto de Larrea tridentata 95%, azadiractina
85% y la mezcla de ácido ascórbico 1% + ácido cítrico 0,25% + ácido láctico
0,25%, sobre Aspergillus flavus, A. fumigatus y Fusarium verticillioides.
Se aplicó un diseño experimental completamente al azar, donde los tratamientos
fueron concentraciones de 0, 1; 10; 100; 1.000 y 10.000 ppm de los inhibidores
extracto de Larrea tridentata 95% y azadiractina 85%, y concentraciones de 0; 1; 10; 100 y
1.000 del inhibidor conformado por la mezcla de ácidos, cada experimento con 4
repeticiones, y se determinó el crecimiento radial e inhibición micelial. La mezcla de ácido ascórbico 1% + ácido cítrico
0,25% + ácido láctico 0,25% a 1.000 ppm inhibió el 100% el crecimiento de, A.
flavus, A. fumigatus
y F. verticillioides, mientras el extracto de Larrea
tridentata 95% y azadiractina
85% produjeron la mayor inhibición en A. fumigatus,
con 74% y 54%, respectivamente, en la concentración de 10.000 ppm. El extracto
de Larrea tridentata 95% ocasionó un 45% de
inhibición micelial en A. flavus
y 61% en F. verticillioides.
Palabras clave: inhibidores; hongos micotoxigénicos; aspergillus
flavus; aspergillus
fumigatus; fusarium verticillioides.
In vitro evaluation of inhibitors against mycotoxigenic
fungi of corn
ABSTRACT
Fungal inhibitors
are alternatives for the management of mycotoxigenic
fungi, such as Aspergillus sp. and Fusarium
sp. The objective of this study was to evaluate the in vitro effect of
the Larrea tridentata
95% extract, azadirachtin 85% and the mixture of
ascorbic acid 1% + citric acid 0.25% + lactic acid 0.25%, on Aspergillus flavus, A. fumigatus
and Fusarium verticillioides.
A completely randomized experimental design was applied, where the treatments
were concentrations of 0.1; 10; 100; 1,000 and 10,000 ppm of the inhibitors Larrea tridentata
95% extract and azadirachtin 85%, and concentrations
of 0; 1; 10; 100 and 1,000 of the inhibitor formed by the mixture of acids,
each experiment with 4 repetitions, the radial growth and mycelial inhibition
were determined. The mixture of 1% ascorbic acid + 0.25% citric acid + 0.25%
lactic acid at 1,000 ppm inhibited 100% growth of A. flavus,
A. fumigatus and F. verticillioides,
while the Larrea tridentata
95% extract and azadirachtin 85% produced the highest
inhibition in A. fumigatus, with 74% and 54%,
respectively, at the 10,000 ppm concentration. The 95% Larrea
tridentata extract caused 45% mycelial inhibition
in A. flavus and 61% in F. verticillioides.
Keywords: fungal inhibitors; mycotoxigenic
fungi; aspergillus flavus,
aspergillus fumigatus;
fusarium verticillioides.
Artículo
recibido: 03 marzo 2022
Aceptado para
publicación: 20 marzo 2022
Correspondencia: yeruti91@gmail.com
Conflictos de Interés: Ninguna que declarar
1.
INTRODUCCIÓN
Las micotoxinas
son metabolitos fúngicos primarios y secundarios que poseen efectos
inmunosupresores, carcinogénicos, mutagénicos y teratogénicos, y se caracterizan por presentar una acción
rápida de intoxicación y una acción lenta de cancerización (Cabañez
2000). La presencia de micotoxinas en los vegetales
puede deberse a varios factores, como la infección de la planta en el campo por
hongos fitopatógenos, la colonización y crecimiento
por hongos saprófitos, patógenos de postcosecha sobre
frutos o granos almacenados, o el desarrollo fúngico de los saprófitos durante
el almacenamiento de productos procesados (Bennett y Klich
2003; Chulze 2010).
En la producción de micotoxinas se destacan tres géneros fúngicos, que pueden ser
asociados con micotoxinas específicas. Los
respectivos géneros fúngicos y micotoxinas son: Aspergillus,
que comúnmente produce aflatoxinas del tipo B1, M1 y
G1, sterigmatocistina y ocratoxina
A; Fusarium, importante productor de fumonisinas,
zearalenona, tricotecenos (deoxynivalenol, toxina T2 y DAS), fusarina
y moniliformina; y Penicillium,
que se destaca como sintetizador de patulina, citrina
y ocratoxina (Araújo 2012; Munkvold 2003). Las especies del género Aspergillus
más importantes como productoras de aflatoxinas son
los de la sección Flavi, que incluyen a A. flavus, A. parasiticus y varias otras especies (Bennett y Klich 2003; Richard 2007), mientras que las especies de Fusarium
más importantes como micotoxigénicas son F. verticillioides, F. proliferatum
y F. graminearum, los cuales básicamente
producen fumonisina, deoxynivalenol
y otras sustancias de importancia secundaria (Sephard
et al. 1996).
Para producir micotoxinas,
controlando el tipo y las cantidades, es necesario primero obtener una alta
sanidad del cultivo, y posteriormente controlar adecuadamente las principales
variables del almacenamiento. Estos factores no actúan por separado, y el grado
de la invasión fúngica dependerá de una interacción entre los mismos (Binder 2007). Como alternativas de manejo se utilizan los
siguientes métodos: físico (Binder 2007), biológico,
térmico, irradiación, absorbentes (Jouany 2007), y el
empleo de compuestos secuestrantes o detoxificantes (Arroyo-Manzanares et al. 2014), así como
los de atmosferas controladas, conservantes o inhibidores naturales (Chulze 2010).
En el manejo de la problemática
generada por hongos en los productos agrícolas, los inhibidores fúngicos son
derivados de diferentes fuentes, como el ácido transcinámico
y el ácido ferúlico, solos o en mezcla (Nesci et al. 2007), quitosano (Cota-Arriola
et al. 2011), propionatos de amonio, de calcio y de
sodio (Moreno-Martínez et al. 2000), y más de 280 extractos vegetales de
diferentes especies de plantas, de las cuales aproximadamente 100 poseen algún
efecto sobre el crecimiento o producción de micotoxinas
(Montes-Belmont y Carvajal 1998).
Los extractos de Neem
Azadirachta indica (azadiractina)
y Larrea tridentata, y los ácidos ascórbico,
cítrico y láctico, son inhibidores fúngicos que presentan efectividad variable
ante algunas especies de Aspergillus y Fusarium (Allameh et al. 2002; Moreno-Limón et al. 2011;
Suárez-Giménez et al. 2007; Tequida-Menezes et al.
2002), y requieren mayores estudios de sus efectos inhibitorios sobre hongos micotoxigénicos, considerando que estos productos están
disponibles comercialmente pero indicados para otros problemas fitosanitarios.
Teniendo en cuenta los aspectos
mencionados, se planteó como objetivo de esta investigación evaluar el efecto in
vitro de los inhibidores extracto de Larrea tridentata
95%; azadiractina 85%; y la mezcla de ácido ascórbico
1% + ácido cítrico 0,25% + ácido láctico 0,25%, sobre los hongos micotoxigénicos Aspergillus flavus,
Aspergillus fumigatus y Fusarium verticillioides.
2.
MATERIALES Y
MÉTODOS
Los trabajos se llevaron a cabo en el
Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Autónoma de Chapingo, ubicado en
el km 38,5 de la carretera México - Texcoco, Chapingo, Estado de México. El
periodo de ejecución del estudio fue entre los meses de mayo y setiembre de
2015.
Las unidades experimentales fueron
placas Petri de 9 cm de diámetro con 20 ml de medio de cultivo papa-dextrosa-agar
(PDA), dispuestas en un diseño experimental completamente al azar, con 4
repeticiones. El mismo experimento fue realizado en dos réplicas para cada
inhibidor y cada especie de hongo evaluado.
Los tratamientos consistieron en
concentraciones de 0; 1; 10; 100; 1.000 y 10.000 ppm de los inhibidores
extracto de Larrea tridentata 95% y azadiractina 85%, y concentraciones de 0; 1; 10; 100 y 1.000
del inhibidor conformado por la mezcla de ácido ascórbico 1% + ácido cítrico 0,25%
+ ácido láctico 0,25%. Los inhibidores se aplicaron agregando las diluciones
requeridas de cada uno de los extractos en el medio de cultivo PDA, para
obtener las respectivas concentraciones, que inmediatamente se vertieron en las
placas Petri (Guerrero-Rodríguez et al. 2007), y se dejó solidificar durante 24
horas. Posteriormente, las placas se inocularon colocando en el centro un disco
de 0,4 cm de diámetro de colonia cultivada de la cepa a evaluar. Las tres
especies de hongos utilizados en el experimento fueron Aspergillus flavus, A. fumigatus y
Fusarium verticillioides. Cada experimento
tuvo una duración de seis días para el desarrollo micelial.
Las variables evaluadas fueron el crecimiento
radial cada 48 horas, para lo cual se trazó una línea diametral por el centro
de la colonia y se midió el crecimiento radial en sentido de la línea, con una
regla graduada en centímetros; y el crecimiento micelial
relativo al testigo absoluto, constituido por el porcentaje de crecimiento micelial en relación al testigo absoluto, considerado como
el 100% de crecimiento.
Los resultados se sometieron a un el
análisis de varianza (ANAVA) y una prueba de comparación múltiple de medias de Tukey (α=0.05). Debido a que los resultados de las dos
réplicas del experimento en un primer análisis resultaron similares
estadísticamente, se concatenó en un solo experimento para el análisis de
varianza final. Se utilizó el software de análisis estadístico SAS versión 9.3.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1
Aspergillus flavus
En las tablas 1 y 2 se presentan los
resultados correspondientes al crecimiento radial y crecimiento micelial relativo al testigo absoluto, respectivamente, de A.
flavus, con diferentes concentraciones de
inhibidores, a los seis días de la inoculación. Se observaron diferencias
estadísticas altamente significativas para los tres inhibidores utilizados.
Tabla 1. Crecimiento radial del micelio (cm) de A. flavus,
con diferentes concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
|
Concentración (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
|
0 |
0,54 |
b |
0,49 |
ab |
0,49 |
b |
|
1 |
0,49 |
b |
0,64 |
bc |
0,54 |
b |
|
10 |
0,46 |
b |
0,72 |
c |
0,5 |
b |
|
100 |
0,44 |
b |
0,58 |
abc |
0,14 |
a |
|
1.000 |
0,43 |
ab |
0,43 |
a |
0 |
a |
|
10.000 |
0,26 |
a |
0,43 |
a |
- |
|
|
CV (%) |
28,86 |
23,24 |
23,69 |
|||
|
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
||||||
Para la mezcla de ácido ascórbico 1%
+ ácido cítrico 0,25% + ácido láctico 0,25%, se observó que la concentración de
1.000 ppm inhibió al 100% el crecimiento micelial del
hongo, y se registró un leve crecimiento en la concentración de 100 ppm (27%
crecimiento micelial relativo al testigo absoluto);
estas dos concentraciones se diferenciaron significativamente de los demás
tratamientos con menor concentración, las cuales no causaron inhibición y
resultaron estadísticamente similares al tratamiento control (0 ppm). Así
también, para el tratamiento con azadiractina 85%,
los valores más bajos de crecimiento micelial fueron
registrados en concentraciones de 1.000 y 10.000 ppm, con promedios similares y
un crecimiento micelial relativo al testigo absoluto
de 94% y 91%, respectivamente (Tabla 2). Este resultado fue similar a lo
observado por Ghorbanian et al., (2008) y Bhatnagar y McCormick (1988), con
A. parasiticus.
Tabla 2.
Crecimiento micelial relativo al testigo (%) del
micelio de A. flavus, con diferentes
concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
|
Concentración (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
|
0 |
100 |
b |
100 |
ab |
100 |
b |
|
1 |
115 |
b |
134 |
ab |
113 |
b |
|
10 |
95 |
ab |
152 |
ab |
107 |
b |
|
100 |
94 |
ab |
121 |
ab |
27 |
a |
|
1.000 |
92 |
ab |
91 |
a |
0 |
a |
|
10.000 |
55 |
a |
94 |
a |
- |
|
|
CV (%) |
27,4 |
30,98 |
35,15 |
|||
|
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
||||||
Sin embargo, el crecimiento micelial fue mayor en las concentraciones de 1, 10 y 100
ppm, inclusive con promedios superiores al testigo, evidenciando que, de
acuerdo a la variación de concentración, podría presentarse un efecto
contradictorio y estimulante de este producto para el crecimiento micelial de A. flavus.
Resultados similares fueron obtenidos por Da Costa et al. (2010) y Allameh et al. (2002), en concentraciones de 5.000 y 50.000
ppm de inhibidor, quienes no observaron efecto del aceite esencial de neem sobre el crecimiento micelial,
pero, sin embargo, comprobaron que se produce una reducción en la producción de
aflatoxinas.
Por otro lado, se observó que en el
tratamiento con extracto de Larrea tridentata
95%, en la concentración 10.000 ppm, el crecimiento micelial
relativo al testigo absoluto fue de 55% (Tabla 2), claramente superior al
crecimiento en las concentraciones menores, entre las cuales no se observó
diferencias significativas, y no se registró un crecimiento micelial
relativo al testigo absoluto menor al 90%.
3.2
Aspergillus fumigatus
En las tablas 3 y 4 se presentan los
resultados correspondientes al crecimiento radial en centímetros de micelio y
crecimiento micelial relativo al testigo absoluto de A.
fumigatus, bajo la acción de diferentes
concentraciones de inhibidores, a los 6 días de inoculación. En este ensayo se
observaron diferencias estadísticas altamente significativas para los 3
inhibidores utilizados.
Tabla 3.
Crecimiento radial del micelio (cm) de A. fumigatus,
con diferentes concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
|
Concentración (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
|
0 |
1,38 |
b |
1,40 |
b |
1,41 |
c |
|
1 |
1,35 |
b |
1,56 |
b |
1,39 |
c |
|
10 |
1,14 |
b |
1,55 |
b |
1,28 |
c |
|
100 |
1,11 |
b |
1,43 |
b |
1,04 |
b |
|
1.000 |
1,11 |
b |
0,72 |
a |
0 |
a |
|
10.000 |
0,35 |
a |
0,49 |
a |
- |
|
|
CV (%) |
20 |
12,25 |
15,48 |
|||
|
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
||||||
La mezcla de ácido ascórbico 1% +
ácido cítrico 0,25% + ácido láctico 0,25% resultó muy eficiente como inhibidor
de crecimiento micelial en concentraciones muy bajas
para ambas especies de Aspergillus, incluso a concentraciones menores de
lo permitido para conservación de productos alimenticios, estimado en un rango
de 1 a 6% (Ribotta y Tadini
2009), lo cual refleja el efecto sinérgico de la mezcla de estos ácidos (Tabla
3). La mezcla de ácido ascórbico 1% + ácido cítrico 0,25% + ácido láctico 0,25%
a 1.000 ppm inhibió completamente el crecimiento de A. fumigatus,
mientras que en las concentraciones menores se observaron crecimientos
considerables, con valores relativos al testigo absoluto de 75% a 100 ppm, y
mayor al 90% a 10 ppm, resultados estadísticamente similares al tratamiento con
1 ppm y el control (Tabla 4) En cuanto al empleo de azadiractina
85%, no hubo diferencias significativas entre los tratamientos con 1.000 y
10.000 ppm, tratamiento que inhibieron el crecimiento micelial
en un 52 y 54%, respectivamente, con un rango de crecimiento radial del micelio
de 1,40 y 1,56 cm.
Tabla 4.
Crecimiento micelial relativo al testigo (%) del
micelio de A. fumigatus, con diferentes
concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
|
Concentración (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
|
0 |
100 |
b |
93 |
b |
100 |
c |
|
1 |
100 |
b |
105 |
b |
100 |
c |
|
10 |
85 |
b |
105 |
b |
91 |
c |
|
100 |
81 |
b |
97 |
b |
75 |
b |
|
1.000 |
82 |
b |
48 |
a |
0 |
a |
|
10.000 |
26 |
a |
46 |
a |
- |
|
|
CV (%) |
25,17 |
18,4 |
12,84 |
|||
|
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
||||||
El extracto de Larrea tridentata al 95%, tuvo su mayor eficacia en la
concentración de 10.000 ppm, dosis en la cual se registró un crecimiento micelial de 0,35 cm (crecimiento micelial
de 26%), diferenciándose de los valores registrados en las demás
concentraciones, que superaron el 80% de crecimiento micelial
relativo al testigo absoluto, y fueron estadísticamente similares al
tratamiento control (Tabla 4).
3.3
Fusarium verticillioides
En las tablas 5 y 6 se presentan los
resultados correspondientes al crecimiento radial del micelio en centímetros y
el crecimiento micelial relativo al testigo absoluto
de F. verticillioides, con diferentes
concentraciones de inhibidores, a los 6 días de inoculación. Similar con lo
observado en A. flavus y A. fumigatus, las diferencias registradas resultaron
altamente significativas para los 3 inhibidores utilizados.
Tabla 5.
Crecimiento radial del micelio (cm) de F. verticillioides,
con diferentes concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
|
Concentración (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
|
0 |
0,88 |
c |
0,88 |
a |
0,88 |
bc |
|
1 |
0,81 |
bc |
1,9 |
d |
1,19 |
d |
|
10 |
0,66 |
b |
2,04 |
d |
1,02 |
cd |
|
100 |
0,98 |
c |
1,68 |
c |
0,7 |
b |
|
1.000 |
1,51 |
d |
1,21 |
b |
0 |
a |
|
10.000 |
0,34 |
a |
1,04 |
a |
- |
|
|
CV (%) |
13,72 |
7,51 |
16,25 |
|||
|
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
||||||
Como lo ocurrido con A. flavus y A. fumigatus,
la concentración de 1.000 ppm, de ácido ascórbico 1% + ácido cítrico 0,25% +
ácido láctico 0,25% inhibió en un 100% el crecimiento de F. verticillioides, en contraste con el tratamiento de 100
ppm, en el cual el crecimiento micelial relativo al
testigo absoluto fue del 80%, inclusive observándose una clara estimulación en
el crecimiento (superiores al 100%) en concentraciones menores (Tablas 5 y 6).
Para azadractina
85%, no hubo inhibición del crecimiento de F. verticillioides,
al contrario, se observó una estimulación del crecimiento (superiores al 100%),
misma tendencia observada en A. flavus cuando
las concentraciones del producto eran menores a 1.000 ppm. Moslem
y El-Kholie (2009), comprobaron efectos inhibitorios
del extracto de neem en F. oxysporum,
al igual que Joseph et al. (2008) en F. solani,
pero cuando las concentraciones fueron superiores a 50.000 ppm; mientras que
Geraldo et al. (2010) observaron un 35% de inhibición del crecimiento de F. oxysporum y F. subglutinans
sometidos a 10.000 ppm de extracto de neem.
Tabla 4.
Crecimiento micelial relativo al testigo (%) del
micelio de F. verticillioides, con diferentes
concentraciones de inhibidores. Texcoco, 2015.
|
Concentración (ppm) |
L. tridentata 95%* |
Azadiractina 85%* |
Ac. asc. 1% +
ac. cit. 0,25% + ac. lac. 0,25%* |
|||
|
0 |
100 |
c |
100 |
ab |
100 |
bc |
|
1 |
93 |
bc |
219 |
b |
138 |
d |
|
10 |
77 |
b |
237 |
c |
118 |
cd |
|
100 |
113 |
c |
195 |
d |
80 |
b |
|
1.000 |
174 |
d |
139 |
cd |
0 |
a |
|
10.000 |
39 |
a |
120 |
a |
- |
|
|
CV (%) |
15,13 |
12,38 |
19,03 |
|||
|
*Medias con letras distintas las columnas
indican diferencias significativas (Tukey
p<=0,05) |
||||||
El extracto de Larrea tridentata 95% por su parte, de modo similar a lo
ocurrido en A. fumigatus, inhibió el
crecimiento de F. verticillioides en la
concentración 10.000 ppm, alcanzando hasta un porcentaje de 39% de crecimiento
relativo al testigo absoluto (Tabla 6). Mayores efectos inhibitorios se
consiguieron con los extractos de Larrea tridentata
95%, en las especies de Aspergillus y Fusarium evaluados, sin
embargo, se requiere una mayor concentración del extracto (Moreno-Limón et al.
2011; Suárez-Giménez et al. 2007; Tequida-Menezes et
al. 2002), el uso de sus constituyentes antifúngicos
(methyl-NDGA) en forma pura (Vargas-Arispuroa et al. 2005), o mezclas con otros inhibidores (Reyes-Munguía
et al. 2014). En estos casos, cuando el objetivo es el desarrollo del producto
para aplicación en materias primas para productos alimenticios, las
concentraciones más elevadas o las mezclas de las mismas, deben realizarse sin
comprometer la inocuidad (Stanley et al. 2007).
4. CONCLUSIÓN
La concentración de 1,000 ppm ácido
ascórbico 1% + ácido cítrico 0,25% + ácido láctico 0,25% inhibió el 100% el
crecimiento de A. flavus, A. fumigatus y F. verticillioides.
La mayor efecto inhibitorio del extracto de Larrea tridentata 95% y azadiractina
85% se registró en A. fumigatus, con 74% y 54%,
respectivamente, en la concentración de 10.000 ppm. El extracto de Larrea tridentata 95% ocasionó un 45% de inhibición del
crecimiento micelial en A. flavus
y 61% en F. verticillioides.
5. LISTA DE REFERENCIAS
Allameh, A.; Razzaghi Abyane, M.; Shams, M.; Rezaee,
M.B.; Jaimand, K. Effects of neem leaf extract on
production of aflatoxins and activities of fatty acid synthetase,
isocitrate dehydrogenase and glutathione
S-transferase in Aspergillus parasiticus. Mycopathologia. v. 54, n.2, p.79-84, 2002.
Araújo Santana, M.C. Principais
tipos de micotoxinas encontradas nos alimentos de animais domésticos. REDVET v.3, n.7, p. 1-18, 2012.
Arroyo-Manzanares,
N.; Huertas-Pérez, J.F.; Gámiz-Gracia, L.;
García-Campaña, M. Control de micotoxinas en
alimentos. Revista Boletín GRASEQA n.7, p.
16-31, 2014.
Bennett, J.W.; Klich M. Mycotoxins. Clinical Microbiology. Review n.16, p.
497-516, 2003.
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