DOI: https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v6i6.4063

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Cómo citar: Rosales-Espinoza, E., Jimenez-Dávalos, J., Sota-Cano , A. F., & Cáceres-Vizarreta , A. I. (2022). Caracterización molecular de la cañihua (chenopodium Pallidicaule aellen). Ciencia Latina Revista Científica Multidisciplinar, 6(6), 9149-9165. https://doi.org/10.37811/cl_rcm.v6i6.4063

RESUMEN

Se realizó una estandarización del método de extracción de ADN para cañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen) y la caracterización molecular mediante marcadores moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Se utilizaron hojas de 40 accesiones de cañihua tomadas del banco de germoplasma del Programa de Cereales y Granos Nativos de la UNALM provenientes de dos provincias de Puno. Se realizó la extracción del ADN mediante el método CTAB. La agregación de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y del etanol 96% permitieron la extracción de ADN de buena calidad. Obtenido el ADN, se realizó la amplificación PCR, PAGE y tinción con nitrato de plata. Se evaluó el porcentaje de loci polimórficos, contenido de información polimórfica y análisis de variancia molecular. Se seleccionaron 7 cebadores que produjeron 52 locus polimórficos de 144 marcadores ISSR, siendo los más informativos 841, 812, 810, 834 y BOR2. Una alta diferenciación genética entre poblaciones fue detectada basada en el AMOVA (Fst = 0.1544). Esto hace suponer que, la posición geográfica marca la diferenciación genética entre poblaciones de diferentes provincias.

Palabras clave: cañihua; chenopodium pallidicaule; issr; marcadores moleculares; CTAB.

Molecular characterization of the cañihua (chenopodium

Pallidicaule aellen) using issr molecular markers

(inter simple sequence repeats)

ABSTRACT

A standardization’s method of DNA extraction for canihua (Chenopodium pallidicaule Aellen) and molecular characterization using ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) molecular markers was performed. Leaves of 40 accessions of canihua from the UNALM Cereals and Native Crops Programme germplasm bank that they came from Puno were used. CTAB extraction of DNA was carried out. The use of chloroform: isoamilic alcohol (24:1) and ethanol 96% produced good quality of DNA extraction. After DNA isolation; PCR amplification, PAGE and silver staining were done. Percentage of polymorphic loci, polymorphic information content and analysis of molecular variance were studied. Seven selected primers yielded 86 polymorphic loci from 144 ISSR markers, from which 841, 812, 810, 834 y BOR2 produced the major information. High genetic difference between populations was detected for AMOVA (Fst = 0.1544). As a consequence, the geographic position could be an important factor in genetic difference between different populations from cities.

Keywords: cañihua; chenopodium pallidicaule; ISSR; molecular markers; CTAB.

INTRODUCCIÓN

El género Chenopodium ha sido cultivado desde hace siglos como una planta para follaje principalmente y en segundo plano para el aprovechamiento de sus granos en diferentes partes del mundo (Taopanta., 2016). Recientemente el género Chenopodium ha despertado interés debido a sus características nutricionales que lo hacen una herramienta poderosa para la lucha contra la malnutrición en muchas partes del mundo (Torreblanca., 2015). La cañihua tiene alto contenido proteico con adecuado nivel de aminoácidos esenciales, destacando la presencia de lisina (Zuñiga, 2014). Las proteínas que contiene este cultivo son de fácil asimilación tal es así, que puede compensar la falta de proteína animal (Quispe, 2018). Los agricultores andinos reconocen en la cañihua un cultivo de gran importancia, debido a su mayor tolerancia a las heladas. Sin embargo, el tamaño pequeño de sus granos, sus bajos rendimientos en kg/Ha (Mayta, 2016) y la falta de maquinaria en la cosecha limitan la expansión de su cultivo (Arnillas et al. 2017). El mismo autor señala que, por décadas la superficie de cultivo de esta especie está alrededor de los 5000 a 7000 has localizadas casi en su totalidad en Puno y su producción no ha superado las 6000 toneladas anuales. Si deseamos aprovechar este recurso genético debemos estudiarlo, conservarlo y seleccionarlo para obtener el máximo beneficio. Por tanto, resulta necesario más conocimiento acerca de las potencialidades de este cultivo, de su entorno y sobre todo su diversidad genética para que, aunado con los estudios agronómicos que se tienen, poder promocionar su cultivo y consumo como recurso alimentario andino.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo de investigación se realizó en el laboratorio de Marcadores Moleculares y tinglado del Programa de Cereales y Granos Nativos de la Universidad Nacional Agraria La Molina.

MATERIAL VEGETAL

Se utilizaron 40 accesiones del Banco de germoplasma del Programa de Cereales y Granos Nativos de UNALM, provenientes de las provincias de Azángaro y Atuncolla del departamento de Puno. Las accesiones crecieron en las instalaciones del Programa de Cereales y Granos Nativos a 240 m.s.n.m. Las accesiones provenientes de Atuncolla fueron 22 y las restantes 18 de Azángaro (tabla 1).

ANALISIS MOLECULAR

1. Extracción de ADN

Las semillas seleccionadas para este estudio fueron sembradas en macetas pequeñas con una combinación de arena y tierra vegetal para crecer en el tinglado a condiciones ambientales. Después de 14 días, se colectaron las hojas jóvenes apicales de las accesiones para ser secadas con Silica Gel (Sigma) durante 30 días. Pasado este periodo, se trasladó el tejido seco a tubos Eppendorf de 2.2 ml de capacidad para ser molidos, con ayuda de perlas de acero y con el molino marca MM200 Retsch. En las muestras molidas se aplicó el método de Doyle and Doyle (1987) modificado para la extracción del ADN (Rosales, 2013). Se ajustaron todas las entradas a 20 ng/µL diluyendo el stock con agua miliQ (agua millipore).

2. Medida de la pureza y concentración del ADN

La determinación de la pureza y concentración del ADN se realizó con ayuda de un Biofotómetro (Eppendorf) midiendo las tasas de absorbancias a 260 nm sobre 280 nm para estimar la pureza del ADN extraído. La concentración del ADN extraído (ng/µl) se obtuvo directamente del Biofotómetro (Eppendorf) mediante la siguiente fórmula empírica: A260 x 50 ng/µl x factor de dilución (198 µl/ 2 µl). Donde 50 ng/µl es por regla general la concentración de ADN cuando se tiene A260 = 1.0 (Kashinskaya et al, 2017).

3. Medida de la calidad del ADN

Fue evaluada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %. El ADN fue visualizado y se capturó su imagen en el Gel Doc 2000 (BIO-RAD) por medio del programa Quantity One.

4. Principio de los ISSR y protocolo

El protocolo consiste en la preparación del coctel de reacción (tabla 2) para proceder a las amplificaciones en el Termociclador Mastercycler gradient Eppendorf 5331 bajo condiciones específicas (tabla 3).

Tabla 2. Coctel de reacción empleado en la detección de marcadores ISSR en Cañihua.

Tabla 3. Programa de amplificación utilizado para Cañihua

Evaluación estadística de los datos moleculares

Para cada genotipo, se amplificaron usando los ISSR y los datos fueron tratados como caracteres únicos. Los datos fueron obtenidos en matrices binarias (1 para presencia y 0 para ausencia). El software usado fue el NTSYS-PC (Rohlf, 2004) para el análisis de las matrices de similitud basado en el coeficiente de Jaccard.

1. Porcentaje de polimorfismo El porcentaje de loci polimórficos se estimó mediante la división del número de loci polimórficos entre el número total de loci por 100 (Nei, 1973)

2. PIC (Índice de contenido polimórfico) Es una medida de diversidad alélica, es decir, que nos da información de un marcador en la población de acuerdo a la frecuencia de los alelos. Este índice es calculado de acuerdo a la estadística de Nei (da Silva et al., 2016):

Donde fi es la frecuencia del i-ésimo alelo detectado y n es el número de alelos analizados en la población. El valor PIC provee un estimado del poder discriminatorio de un marcador en la población.

3. Análisis de diferenciación genética

La distancia genética provee una forma de medir la probabilidad de encuentro de alelos iguales (endogamia). Uno de los índices estadísticos usados es el Fst el cual mide el grado de diferenciación génica entre las poblaciones, en función de las frecuencias alélicas. Para calcular el valor Fst recurrimos al programa Arlequin ver 3.1 (Vilches et al. 2012).

Los valores de FST muestra una numeración que va desde cero (no existe divergencia genética) hasta 1 (fijación para alelos alternos en diferentes subpoblaciones). La interpretación de estos valores se muestra en la siguiente tabla.

Tabla 4. Rangos asignados para la diferenciación genética (IPGRI y Cornell University, 2004)

4. Coeficiente de similitud

Para este estudio, se utilizó el coeficiente de Jaccard, el cual está definido por:

Donde “a” representa los 1,1; “b” representa las combinaciones 1,0; “c” las combinaciones 0,1.

El coeficiente de Jaccard omite las ausencias conjuntas. La idea de usar este coeficiente radica en que la ausencia de bandas polimórficas puede deberse a diversos factores y no necesariamente refleja diferencias entre las muestras evaluadas, mientras que el concepto básico es una medida de diferencias (similitudes o disimilitudes) por medio de la ocurrencia de bandas polimórficas (presencia de alelos).

5. Análisis de agrupamiento (Cluster)

El análisis de cluster es un método que permite descubrir asociaciones y estructuras en los datos que no son evidentes a simple vista, pudiendo ser útiles una vez que se han encontrado. La finalidad de esta técnica es formar grupos de muestras, poblaciones, individuos u OTUs que tengan similitud entre sí y diferencias entre los OTUs de los otros grupos. El criterio para la formación de grupos es agrupamientos jerárquicos, es decir, dada la matriz de distancias o de similitudes se desea clasificar los elementos en una jerarquía en donde los elementos son sucesivamente asignados a los grupos.

6. El dendrograma o árbol jerárquico

Es una representación gráfica del resultado del proceso de agrupamiento en forma de árbol. El término dendrograma agrupa a los fenogramas y cladogramas (Morales, 2019). Para la elaboración del dendrograma se recurrió al método de agrupamiento basado en distancias UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages), para ello se utilizó el programa NTSYS pc 2.0. Roca, 2015, manifiesta que el UPGMA es una metodología típicamente usada para el análisis genético al usar marcadores moleculares dominantes (RAPDs, ISSR y AFLP).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Extracción y cuantificación de ADN

La diferencia entre el método usado en esta investigación y el original de Doyle y Doyle (1987) consiste en la utilización del Cloroformo – alcohol isoamílico (24:1) como solvente orgánico adicionado por segunda vez y prescindir del isopropanol (que actúa como agente precipitante junto con el NaCl), en su lugar se utilizó alcohol etílico a dos porcentajes, el de 96% y de 70%. Con estas modificaciones, se obtuvo un precipitado de coloración blanquecina después de someter cada genotipo al protocolo descrito. Los valores cuantitativos de concentración de ADN y rango de pureza se muestran en el cuadro 7, donde la lectura en el espectrofotómetro indica valores en un rango de 497 a 7683 ng/uL de concentración de ADN; dando un promedio con todos los valores de 2300 ng/uL.

Pineda et al. (2021) manifiesta que en la determinación espectrofotométrica de la pureza del ADN el rango de lectura de la solución se debe realizar en 260/280 nm observándose un valor cercano a 1.8, ya que valores lejanos por encima de este número indicarían la presencia de ARN la cual se evalúa a su vez con una electroforesis en gel de agarosa. Por otro lado, valores por debajo de 1.8 frecuentemente indican la presencia de contaminantes como proteínas o fenol. De los resultados obtenidos (tabla 5) el 73 % de los valores obtenidos se encuentran en el rango de 1.8 a 2.0. El mismo autor manifiesta que el rango de lectura 260/280 determina la cantidad de contaminación orgánica, ya que si las lecturas de absorbancias de las muestras están dentro del rango de 1.80 a 2.00 son consideradas como libres de contaminantes. Zhang et al. 2013, indica que el cociente DO 260/280 no es exclusivo indicador de la pureza del ADN sino que se complementa con la concentración del material genético obtenido.

Tabla 5. Valores obtenidos de concentración de ADN y rango de pureza en la lectura con el Biofotómetro a λ: 260-280 nm

Selección de cebadores De los 65 cebadores ISSR existentes en el programa de Cereales y Granos Nativos de la UNALM, se determinó que el 11 % (7 cebadores) presentaron polimorfismo en las amplificaciones, estos cebadores fueron: 810, 812, 825, 834, 835, 841 y BOR2. En la tabla 6 se presenta la secuencia de los cebadores usados en esta investigación.

Tabla 6. Secuencia de los iniciadores usados en la detección de polimorfismo en Cañihua.

Evaluación estadística de los datos moleculares

I. Porcentaje de polimorfismo

La lectura de los geles de poliacrilamida fue de 200 – 2000 bp (Alcázar et al. 2019) para la obtención de los valores de presencia y ausencia de bandas polimórficas. Los genotipos evaluados de Chenopodium pallidicaule muestran la cantidad de bandas amplificadas (tabla 7) las cuales van desde 11 hasta 33, siendo el total de bandas 144 las detectadas con los marcadores ISSR, de las cuales 52 loci fueron polimórficos.

El porcentaje de polimorfismo de las accesiones evaluadas van desde 20% hasta 63.64% para cada cebador ISSR. El promedio de polimorfismo es de 38.82%. En la tabla 7, se observa que el cebador 825 generó mayor porcentaje de polimorfismo con 63.64%, le sigue el cebador 810 con 61.11%.

Jiménez (2006) en su evaluación genética de la cañihua usando AFLP obtuvo un porcentaje de polimorfismo inter-accesión de 33% y 27%, intraaccesión respectivamente, con estas dos evaluaciones el autor indica una alta tasa de polinización cruzada en este cultivo.

II. PIC (Índice de contenido polimórfico)

La obtención del Índice de contenido polimórfico se observa en la tabla 7. En donde los valores del PIC variaron desde 0.18 para el cebador 835 hasta 0.57 para el cebador 841. Un mayor valor del PIC indica un marcador ISSR más informativo. Según este índice los cebadores 841, 812, 810, 834 y BOR2 podrían ser usados en futuras caracterizaciones del germoplasma de cañihua. Terzopoulos et al., (2008) muestran en sus estudios que cada cebador amplifica diferente patrón obteniendo diferente número de bandas polimórficas; así por ejemplo, los cebadores 810 y 825 ambos con temperatura de anclaje (annealing) de 51 °C fueron seleccionados como polimórficos en el estudio de variación genética de especies de Angustifoliate (Bednarskaya et al. 2014). El cebador 835 fue seleccionado como polimórfico para análisis en Chenopodium quinoa, una especie arbórea en peligro de extinción (Tamayo, 2010)

Tabla 7. Total de bandas (polimórficas y monomórficas) y valor PIC para cada cebador usados en Cañihua.

III. Medida de la diferenciación regional

Se utilizó el software Arlequín ver 3.1 para la evaluación de las poblaciones de Puno y Azángaro, encontrándose que el valor Fst para 1000 permutaciones es de 0.1544 indicando moderada diferenciación genética entre las poblaciones evaluadas.

IV. Análisis multivariado

IV.I. Análisis de agrupamiento (Cluster)

De acuerdo al fenograma inter accesión (figura 1), en su mayoría, las muestras se agruparon de acuerdo a su distribución geográfica. Se observó a una similitud de 0.88 una clara distinción de 4 conglomerados (I, II, III, IV) Al formar 4 grupos se observa que el conglomerado I posee 24 muestras, de las cuales 21 pertenecen a Atuncolla. El segundo grupo (conglomerado II) lo conforman 10 muestras pertenecientes todas ellas a Azángaro. Las accesiones PUCNÑ 68 y PUCNÑ 107 que pertenecen a Azángaro forman el tercer conglomerado. Finalmente, el último grupo (IV) con 4 accesiones tiene genotipos tanto de Atuncolla (PUCNÑ 46) como de Azángaro (PUCNÑ 88, PUCNÑ 90 Y PUCNÑ 63). Probablemente, la razón por la cual en el conglomerado I existan 3 accesiones pertenecientes a Azángaro de una mayoría que pertenece a Atuncolla sea el intercambio de semillas que puede darse en ferias locales o simple intercambio entre predios. La misma razón podría explicar que exista una accesión de Atuncolla en un grupo donde predominan las accesiones provenientes de Azangaro en el conglomerado IV.

Considerando que las accesiones se agruparon según distribución geográfica (conglomerado I pertenece a Atuncolla y los conglomerados II, III y IV a Azángaro), podríamos indicar que existe diferenciación genética entre las poblaciones de Atuncolla y Azángaro tratándose del mismo cultivo. Jin et al., (2007) manifiestan que para poblaciones pequeñas distribuidas en ambientes como riscos o valles que tienen pobres condiciones de crecimiento se dan 2 consecuencias genéticas: el incremento de la deriva génica y la endogamia. Esto implica que las barreras naturales pueden provocar el inicio de una diferenciación genética; en nuestro estudio, el distrito de Azángaro se encuentra en un valle que difiere de aproximadamente 88 kilómetros hasta el distrito de Atuncolla.

Figure 1. Dendograma del análisis cluster basado en el coeficiente de similitud de Jaccard usando el método UPGMA para las 40 accesiones de Cañihua.

IV.II. Dendrograma

Los resultados obtenidos aplicando el coeficiente de similitud de Jaccard, se muestran en la figura 2. El coeficiente de similitud máximo entre las muestras de Atuncolla es de 0.983, de la misma manera, el de Azángaro es de 0.953. Indicándonos que las muestras de Azángaro muestran mayor diversidad. De igual manera, estos resultados indican que los marcadores ISSR son herramientas poderosas para detectar bajos niveles de variación genética entre accesiones (Castañeda-Cardona et al., 2021) inclusive entre valores de coeficiente de similitud cercanos (0.983 y 0.953).

CONCLUSIONES

-La utilización del Cloroformo – Alcohol isoamilico (24:1) en una segunda oportunidad como solvente orgánico así como el reemplazo en el uso del isopropanol por etanol 96% y 70%, permiten la obtención de alta concentración y buen rango de pureza del ADN extraído en Chenopodium pallidicaule.

-Con los marcadores ISSR se pudo evaluar las diferencias entre las accesiones analizadas, mostrando baja diversidad entre grupos geográficamente diferentes.

-Los cebadores ISSR 841, 812, 810, 834 y BOR2 pueden ser usados en posteriores estudios para Chenopodium pallidicaule, ya que presentan un PIC entre 0.38 y 0.57.

-El valor Fst usando el programa Arlequin indicó que existe diferenciación genética entre las poblaciones de Azángaro y Atuncolla

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