Evaluaci�n
de las fases del ciclo estral de la rata mediante frotis vaginales y mediciones
hormonales
|
Leonor Estela Hern�ndez L�pez[1] https://orcid.org/0000-0003-1742-4603 Instituto Nacional de Psiquiatr�a, ��Ram�n de la Fuente Mu�iz��, M�xico.
|
Ricardo Mondrag�n Ceballos https://orcid.org/0000-0002-3252-8702 Instituto Nacional de Psiquiatr�a, ��Ram�n de la Fuente Mu�iz��, M�xico.
|
|
https://orcid.org/0000-0002-4626-615X �Universidad Aut�noma del Estado de Quintana Roo. �Quintana Roo.
|
|
RESUMEN
El ciclo ov�rico es el proceso de selecci�n, maduraci�n y crecimiento folicular hasta la ovulaci�n y la preparaci�n del �tero para la gestaci�n. Ocurre mediante la intercomunicaci�n entre los ovocitos, las c�lulas de la granulosa, c�lulas de la teca y diversas c�lulas del sistema inmune y end�crino. Las funciones celulares est�n reguladas por las hormonas hipofisiarias: luteinizante (LH) y fol�culo estimulante (FSH), junto con los esteroides ov�ricos: estr�genos, andr�genos y progest�genos. Las variaciones en las concentraciones hormonales generan cambios f�sicos, cognitivos y emocionales en las hembras. Por lo que, al incluirlas como modelos en los protocolos de investigaci�n, resulta necesario evaluar las fases y duraci�n de los ciclos, pues estas variables pueden sesgar los resultados. Para el seguimiento de las fases se han desarrollado diferentes m�todos, siendo la evaluaci�n de la citolog�a vaginal el m�s utilizado aunque poco preciso. Por el contrario, las mediciones hormonales s�ricas, urinarias, fecales o salivales son m�s precisas, pero costosas y tardadas. Consecuentemente, lo ideal ser�a la combinaci�n de varias t�cnicas de evaluaci�n. Sin embargo, la decisi�n depender� de la naturaleza de cada experimento. Esta revisi�n describe, los mecanismos fisiol�gicos del ciclo estral y las hormonas que act�an en cada etapa. Describe el ciclo ov�rico de la rata adulta, ya que es la especie m�s usada en el laboratorio como modelo experimental, incluye la evaluaci�n de los cambios celulares del epitelio vaginal, describiendo las principales t�cnicas de tinci�n. Por �ltimo, refiere los m�todos de medici�n hormonal m�s comunes con sus ventajas y desventajas.
Palabras clave: ciclo estral; citolog�a vaginal; medici�n hormonal; rata.
Evaluation of the phases of the estrous cycle of the rat by means of vaginal smears and hormonal measurements
ABSTRACT
The ovarian cycle is a process of selection, maturation and follicular growth until ovulation and the preparation of the uterus for gestation. These events occur through the intercommunication between oocytes, granulosa cells, theca cells, and the immune and endocrine systems. These structures are regulated by pituitary hormones: luteinizing and follicle stimulating, altogether with ovarian steroids: estrogens, androgens and progestins. Throughout each cycle, variations in hormonal concentrations generate physical, cognitive, and emotional changes in females. For this reason, when including them in research protocols, it is necessary to consecutively evaluate the phases of the cycles, the duration of the phases and whether the cycles are ovulatory or anovulatory, among others, as these variables could bias the results obtained. Different methods have been developed to monitor the phases, the evaluation of the vaginal cytology being the simplest, cheapest, and fastest, although not very accurate. In contrast, serum, urinary, fecal, or salivary hormone measurements are more accurate, but expensive, and results cannot be obtained immediately. Consequently, the ideal could be the combination of diverse evaluation techniques, however, the decision will depend on the nature of each experiment. In this review, we describe, succinctly, the physiological mechanisms that underlie each phase of the estrous cycle and the hormones that act predominantly in each stage. Subsequently, we described the ovarian cycle of the rat, which is one of the most used species in the laboratory, by the evaluation of the cellular changes of the vaginal epithelium, describing the main staining techniques. Finally, are referred the most common hormonal measurement methods with their advantages, and disadvantages.
Keywords: estrous cycle; vaginal cytology; hormonal measurement; rat.
Art�culo recibido 01 abril 2023
Aceptado para publicaci�n: 15 abril 2023INTRODUCCI�N
En 1917 Stockard y Papanicolaou estudiaron los cambios que ocurr�an con respecto al volumen, textura del moco cervical y el epitelio vaginal de varias hembras de cuyo (Stockard & Papanicolaou, 1917). Analizaron diariamente a estos animales por un per�odo de tiempo prolongado y as� establecieron las cuatro fases de los ciclos estrales en esta especie, su duraci�n y el tiempo promedio de cada ciclo. Este estudio fue el primero en develar que el epitelio vaginal cambiaba de manera simult�nea con los ciclos ov�ricos. Pocos a�os despu�s, en 1922 Evans y Long basados en ese trabajo, publicaron el ciclo estral de la rata (Evans & Long, 1922) y la ratona, adem�s de la presencia de las hormonas hipofisiarias luteinizante (LH) y fol�culo estimulante (FSH), demostrando su interacci�n con el ovario y el �tero. Un a�o m�s tarde, Allen y Doisy (1923) describieron el efecto de los estr�genos y andr�genos ov�ricos en los �rganos reproductivos. Posteriormente a estos trabajos, que fueron los pioneros sobre los ciclos ov�ricos, un gran n�mero de investigadores se han dedicado a averiguar m�s detalladamente los procesos fisiol�gicos que subyacen a estos ciclos y los cambios funcionales y anat�micos que generan.
Se conoce que los ciclos ov�ricos son los procesos de selecci�n, maduraci�n y crecimiento folicular hasta la ovulaci�n y la preparaci�n del �tero para la gestaci�n. Estos eventos ocurren a trav�s de la intercomunicaci�n entre los ovocitos, c�lulas de la granulosa, c�lulas de la teca y los sistemas inmunitario, end�crino y vascular (Richards, 2018). Todas esas estructuras y sistemas est�n regulados por se�ales hipotal�micas e hipofisiarias, que act�an mediante neurotransmisores y hormonas, adem�s de la expresi�n de una gran variedad de genes (Albertini, 2015; Reddy et al., 2008). El equilibrio y la eficacia de estos procesos son indispensables para que la reproducci�n de la hembra sea exitosa, de ah� la importancia de estudiarlos y entenderlos a cabalidad. Por otra parte, las variaciones c�clicas de las concentraciones de las hormonas sexuales tienen una gran repercusi�n no s�lo en lo concerniente a lo reproductivo, sino tambi�n en algunos procesos cognitivos y emocionales de las hembras (Farage et al., 2010; Le et al., 2020), los cuales han sido atendidos por la neurociencia. Sin embargo, a pesar de lo mucho que ya se conoce en esta �rea, todav�a existen algunos aspectos que no est�n totalmente esclarecidos, por lo que hoy en d�a contin�an las investigaciones a este respecto.
Cabe mencionar que, dado que cada fase del ciclo est� regulada por diferentes mecanismos neuroendocrinos que influyen en diversos aspectos tanto fisiol�gicos como conductuales, es importante conocer el estado reproductivo en el que se encuentran las hembras en estudio. Es por esto por lo que se han ido desarrollado t�cnicas como la medici�n hormonal s�rica, fecal, urinaria o salival (para determinar con la mayor exactitud posible y menos invasiva) la influencia hormonal en las fases del ciclo estral (Dorgan et al., 2002; Faupel-Badger et al., 2010), que, si bien es cierto que estas mediciones no permiten hacer un seguimiento diario, s� son de utilidad para cotejar a posteriori los cambios en la citolog�a vaginal con los niveles hormonales. Por lo tanto, la evaluaci�n diaria por citolog�a vaginal de los ciclos estrales no cae en desuso por su utilidad al ser una t�cnica poco invasiva, descriptiva, econ�mica e inmediata, pero por ser poco exacta es muy conveniente incluir, a la par, mediciones hormonales seriadas.
Generalidades del ciclo ov�rico y su regulaci�n hormonal
Todos los eventos que ocurren durante los ciclos ov�ricos por efecto de las hormonas hipofisiarias y los esteroides ov�ricos tienen dos finalidades: producir ovocitos maduros listos para ser ovulados y posteriormente fertilizados y preparar al tracto reproductor de la hembra para la implantaci�n del o los huevos ya fecundados. As�, en cada etapa del ciclo suceden adecuaciones tanto del sistema reproductor como del neuroend�crino para que se lleve a cabo la reproducci�n de manera exitosa.
El ciclo ov�rico se divide en las fases: folicular o proestro, periovulatoria o estro, l�tea o metaestro y diestro, que en los ciclos menstruales incluye la menstruaci�n (Cora et al., 2015). La duraci�n de cada una de esas fases var�a seg�n la especie, pero en todos los mam�feros los ciclos ov�ricos est�n regulados por la interrelaci�n de las gonadotropinas hipofisiarias: LH y FSH, los esteroides ov�ricos: estr�genos, andr�genos y progest�genos (Owen, 1975) y la inhibina una hormona gonadal no esteroidal (Zeleznik & Plant, 2015)
Ovarios
Durante el desarrollo embrionario de las hembras se activa la transcripci�n del gen Star8 y Dazl los cuales provoca que las c�lulas germinales primordiales detengan su divisi�n celular en el diploteno de la profase I de la meiosis (Liu et al., 2009; Falender et al., 2005), donde permanecer�n hasta el momento de la ovulaci�n. Esas c�lulas se rodean de una capa de c�lulas som�ticas o c�lulas pregranulosas formando los fol�culos primarios. Posteriormente, cuando las hembras entran a la edad reproductiva se reactiva el crecimiento y la diferenciaci�n de las c�lulas germinales primarias y es en ese momento cuando las hormonas hipofisiarias empiezan a jugar un papel determinante (Richards, 1980).
Foliculog�nesis
En los estadios tempranos del desarrollo folicular, los fol�culos son especialmente sensibles a la FSH, esta hormona facilita la producci�n de estr�genos en las c�lulas de la granulosa y la producci�n de inhibina (Zeleznik & Plant, 2015). El incremento local de estradiol induce la liberaci�n de factores de crecimiento que favorecen el desarrollo del fol�culo (Pangas & Rajkovic, 2015). Asimismo, el estradiol junto con la FSH y la inhibina promueven la s�ntesis de receptores para LH en el fol�culo. La LH se une a los receptores de las c�lulas de la teca que producen principalmente andr�genos, los cuales son aromatizados a estr�genos por el complejo enzim�tico p450arom (aromatasa) en las c�lulas de la granulosa (Fitzpatrick & Richards, 1994), que son las c�lulas que van rodeando al ovocito conforme va madurando. El inicio del proceso de maduraci�n del ovocito empieza a partir de que �ste se rodea de la zona pel�cida, una capa de glicoprote�nas que le sirve de protecci�n y reconocimiento de los gametos de las especies. A su vez, al momento de la fecundaci�n, durante la reacci�n cortical y de zona, inhibe la poliespermia y una vez fecundado, evita la infiltraci�n de leucocitos y microorganismos (Lefi�vre et al., 2004). �����
Adem�s de los esteroides, tanto en las c�lulas de la granulosa como de la teca, tambi�n se producen otras substancias que est�n mediadas por la m�xima secreci�n de LH, tales como prostaglandinas, citocinas quimiot�cticas y mediadores paracrinos asociados con la inflamaci�n (Duffy et al., 2019). Esos mediadores activan al sistema inmune atrayendo c�lulas de defensa que debilitan la l�mina basal y facilitan la invasi�n de c�lulas endoteliales. Los mediadores inflamatorios, junto con las prostaglandinas, por un lado, activan los genes que controlan la formaci�n y estabilizaci�n de la matriz del complejo ovocito-c�mulo celular (COC) y por otro, desencadenan la expansi�n del c�mulo, reanudan la meiosis del ovocito y favorecen el desprendimiento del COC de las c�lulas de la granulosa basal (Duffy et al., 2019).
Ovulaci�n
Cuando el ovocito completa su proceso de maduraci�n, las concentraciones de estradiol alcanzan sus niveles m�ximos (Richards, 1980; Zeleznik & Plant, 2015). La m�xima secreci�n de estradiol act�a como una se�al de ovulaci�n, provocando un aumento de la LH el cual inhibe a la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) y a la inhibina que, en roedores, se produce en el l�quido folicular durante su desarrollo (Fujii et al., 1983). Contrariamente en primates, incluidas las mujeres, la inhibina no se produce en el fol�culo sino en el cuerpo l�teo y su funci�n es detener la producci�n de la FSH (Han et al. 2023).
La progesterona se produce en peque�as cantidades en los fol�culos preovulatorios, se une a los receptores del n�cleo de las c�lulas de la granulosa y juega un papel esencial en la expresi�n de los genes involucrados tanto en la ovulaci�n como en la formaci�n del cuerpo l�teo (Mishra et al., 2015). Sin embargo, la mayor producci�n de esta hormona ocurre hasta despu�s de la ovulaci�n. Las c�lulas de la granulosa remanentes del fol�culo que ovul� se luteinizan a trav�s de la acci�n de factores angiog�nicos que provienen del fluido folicular (Frederick et al., 1984). Dichos factores promueven la proliferaci�n de capilares sangu�neos y fibroblastos en la l�mina basal de las c�lulas de la granulosa. A trav�s de esa nueva microcirculaci�n, el colesterol llega a las c�lulas luteinizadas y se convierte en progesterona por la acci�n del citocromo P450 y la alfa-hidroxi-deshidrogenasa (Taraborrelli, 2015). La fase l�tea en algunos mam�feros termina en cuanto el �vulo es fecundado y se produce la implantaci�n en el tejido uterino, pues en ese momento el cuerpo l�teo es reclutado por el efecto de la gonadotropina cori�nica (Srisuparp et al., 2001) y no de la progesterona (Halasz & Szekeres-Bartho, 2013). Si la fertilizaci�n e implantaci�n no ocurren, empieza la regresi�n o lisis del cuerpo l�teo en cuerpo albicans o blanco. Al principio de la fase l�tea la producci�n de progesterona es constante, posteriormente empieza a producirse en pulsos sincronizados con los de la LH, y conforme va pasando el tiempo la frecuencia de los pulsos se va espaciando (Wuttke et al., 2001). Por esa raz�n es que las concentraciones de progesterona se mantienen elevadas solamente durante la fase l�tea temprana, posteriormente empiezan a descender hasta que en la fase l�tea tard�a las concentraciones son muy bajas (Wuttke, et al., 2001). �
En s�ntesis, el estradiol se produce en las c�lulas de la granulosa durante el desarrollo folicular. Sin embargo, los andr�genos que se originan en las c�lulas de la teca bajo la influencia de la LH promueven la actividad de la aromatasa estimulada por la FSH para transformar a los andr�genos en estr�genos (Barbieri, 2014). Por lo tanto, la bios�ntesis de los estr�genos totales producidos en el fol�culo en crecimiento sucede por la influencia de las hormonas gonadotr�picas y requiere de la interrelaci�n entre las c�lulas de la granulosa y de la teca del fol�culo, a lo que se le conoce como �la teor�a de las dos c�lulas y dos gonadotropinas� (Barbieri, 2014; Yen et al., 2019).
La funci�n de los estr�genos es, incrementar la actividad arom�tica responsable de su propia formaci�n, promover la foliculog�nesis, incrementar la expresi�n de receptores para gonadotropinas (Lee et al., 2021), incrementar la s�ntesis de conexinas entre las c�lulas de la granulosa (Kaushik et al., 2020) e inhibir su apoptosis (Richards, 2018).
Los andr�genos por su parte promueven la s�ntesis de progestinas y la actividad de la aromatasa para incrementar los niveles de estr�genos (Zeleznik y Plant, 2015). Sin embargo, el equilibrio entre las hormonas hipofisiarias y la producci�n de esteroides ov�ricos es muy sensible, ya que, por ejemplo, en ausencia de gonadotropinas los andr�genos producen atresia folicular, apoptosis ov�rica y luteinizaci�n temprana del fol�culo (De Tomasi et al., 2012; Rosales Torres & S�nchez Guzm�n, 2008). Asimismo, si la concentraci�n de andr�genos como la dihidrotestosterona por ejemplo, es m�s alta de lo normal, puede inhibir la actividad de la aromatasa en las c�lulas de la granulosa (Richards, 1980).
Por �ltimo, la funci�n de la progesterona es esencial tanto para la ovulaci�n, como para la luteinizaci�n del fol�culo despu�s de la ovulaci�n. Si los niveles de esta hormona se mantienen por debajo de lo normal, el porcentaje de ovulaci�n disminuye provocando infertilidad aun cuando los ciclos sean regulares (Hansen et al., 2018).
Esta breve descripci�n de los eventos que ocurren durante el desarrollo y maduraci�n del fol�culo ov�rico, para culminar en la ovulaci�n y la formaci�n del cuerpo l�teo muestran someramente el efecto de los esteroides sexuales y las hormonas hipofisiarias en el ovario, A continuaci�n, se describen los efectos de estas mismas hormonas en los cambios del epitelio vaginal a lo largo del ciclo ov�rico de la rata por ser el modelo animal m�s usado en los laboratorios. ���
Ciclo estral de la rata y su evaluaci�n por citolog�a vaginal
De acuerdo con Evans y Long (1922) el ciclo estral de la rata tiene una duraci�n total de entre 4 y 5 d�as. Se divide en cuatro fases que tienen una duraci�n promedio de: 12 a 18 horas de proestro, entre 9 y12 horas de estro, metaestro de 10 a 14 horas y el diestro que es la fase m�s larga, con una duraci�n de 55 a 72 horas. Sin embargo, algunos autores dividen los ciclos solamente en proestro, estro y diestro (Goldman et al., 2007), mientras que otros, toman en consideraci�n las fases de transici�n que incluyen el momento entre una fase y otra. En esos casos los cambios en el epitelio vaginal a�n no se pueden identificar como caracter�sticos de una fase determinada, por lo tanto, se clasifican como de transici�n y se calcula que las concentraciones hormonales que rigen la fase a�n no est�n en los niveles m�ximos. Por tanto, la clasificaci�n de las fases del ciclo estral puede hacerse arbitrariamente dependiendo de la naturaleza del trabajo que se est� llevando a cabo. �
El seguimiento de las fases por citolog�a vaginal es �til siempre y cuando se tomen en cuenta algunas consideraciones. En primera instancia, los roedores por ser especies nocturnas son muy sensibles a los cambios de horas luz-oscuridad, as� que las citolog�as vaginales se deben colectar preferentemente a la misma hora y mantener a las hembras en un r�gimen horario de 12 horas luz por 12 oscuridad (Cora et al. 2015). Con respecto a otros factores que pueden generar variaciones en los ciclos son: la edad, el estado nutricional, el estr�s, las relaciones sociales y la temperatura. Por lo que es importante reducir al m�ximo cualquier factor que pueda generar variaciones en los ciclos (Cora et al. 2015). �
La evaluaci�n de las fases del ciclo ov�rico por citolog�a vaginal se hace observando la presencia y proporci�n de las c�lulas del epitelio vaginal, su forma y tama�o de sus n�cleos. Adem�s de la manera en que est�n dispuestos los c�mulos celulares. De acuerdo con esas caracter�sticas las c�lulas epiteliales se dividen en: parabasales, intermedias, superficiales y de descamaci�n (Antonov, 2017). Estas c�lulas indican el grado de diferenciaci�n de las c�lulas del epitelio escamoso simple del canal vaginal por el efecto de las hormonas sexuales. Por otra parte, otras caracter�sticas �tiles en la evaluaci�n de las citolog�as vaginales son, la cantidad y consistencia del moco cervical, y la presencia de leucocitos y eritrocitos.
Las c�lulas epiteliales
superficiales y de descamaci�n son las m�s maduras y las menos cercanas a la
l�mina basal (Cora, et al. 2015) Estas c�lulas se caracterizan por ser acid�filas
(tambi�n conocidas como eosinof�licas) por lo que se aprecian de color rosa al
usar cualquier t�cnica de tinci�n multicrom�tica. Por el contrario, las c�lulas
parabasales son bas�filas (o cianof�licas) se ti�en de color azul a violeta (Paccola
et al., 2013).�
Figura 1. Fases del ciclo estral de la rata. A: proestro; B: estro; C: metaestro; D: diestro; I: c�lulas intermedias; L: leucocitos; N: n�cleos celulares; P: c�lulas parabasales; S: c�lulas superficiales; SC: c�lulas de descamaci�n.
Proestro
Esta fase, como su nombre lo indica, se presenta antes del estro que es la fase durante la que ocurre la ovulaci�n. La citolog�a vaginal de una rata hembra en proestro se distingue por la presencia de c�lulas superficiales nucleadas, estas c�lulas son angulares con sus bordes muy bien definidos (Cora et al., 2015; Goldman et al., 2007; Toral Delgado, 2017). En esta fase no se observan leucocitos. En el caso de que se tomen en cuenta las fases intermedias, en el proestro temprano se pueden observar c�lulas intermedias. Dichas c�lulas denotan la transici�n de las c�lulas parabasales a superficiales, por lo que son c�lulas que a�n no tienen los bordes definidos y los n�cleos, aun cuando todav�a se observan grandes, ya no ocupan el mayor volumen del citoplasma. Mientras que en el proestro tard�o, predominan las c�lulas superficiales y se pueden empezar a observar c�lulas de descamaci�n, las cuales son mucho m�s abundantes en el estro (Fig. 1)
Estro
Esta fase ocurre generalmente a medianoche. Se caracteriza porque el epitelio vaginal alcanza su mayor crecimiento y por ese motivo se observa una gran poblaci�n de c�lulas epiteliales de descamaci�n (Cora et al., 2015; Goldman et al., 2007; Toral Delgado, 2017). Estas c�lulas son anucleadas, transl�cidas y normalmente se encuentran en c�mulos rodeados de moco cervical blanquecino (Fig. 1). No se observan leucocitos, sino hasta que empieza la fase de transici�n tard�a donde empiezan a aumentar.
Metaestro
En esta fase la poblaci�n de leucocitos (b�sicamente neutr�filos) aumenta de manera importante. Todav�a se pueden observar c�lulas escamosas, pero la presencia de c�lulas intermedias es predominante en la citolog�a vaginal. El metaestro se considera una fase de transici�n entre el estro y el diestro (Cora et al., 2015; Goldman et al., 2007; Toral Delgado, 2017). Al final de esta fase empiezan a aumentar las c�lulas parabasales (Fig. 1). ���
Diestro
Esta es la fase m�s larga del ciclo. Se distingue porque el epitelio vaginal tiene el menor n�mero de estratos celulares y por lo tanto las c�lulas que se observan en la citolog�a son predominantemente leucocitos y c�lulas parabasales que aumentan conforme avanza la fase (Cora et al., 2015; Goldman et al., 2007; Toral Delgado, 2017). Las c�lulas parabasales se distinguen por ser c�lulas redondas, de n�cleos grandes que ocupan casi todo el citoplasma y se ti�en de color azul. Se observan en c�mulos tipo �racimo de uvas� y en todo momento se siguen observando leucocitos alrededor de las c�lulas epiteliales. Nuevamente, al final del diestro, que ser�a la fase de transici�n para iniciar nuevamente el ciclo, se empiezan a observar c�lulas intermedias y algunas superficiales, asimismo, mientras que empieza a decrecer la poblaci�n de leucocitos (Fig. 1). (Paccola et al., 2013; Cora et al., 2015).
Pre�ez
Si la hembra es pre�ada, en la citolog�a vaginal se observan c�lulas intermedias, leucocitos y moco cervical (Beky�rek et al., 2002).
Senectud
La citolog�a vaginal en hembras seniles se caracteriza por la presencia de c�lulas de descamaci�n a intervalos irregulares y por periodos prolongados combinada con leucocitos (Ingram, 1959).
T�cnicas para la colecta y tinci�n de frotis vaginales
Los frotis vaginales se pueden colectar por lavado vaginal. En ratas se introduce con un gotero de 0.2 a 0.25 ml de soluci�n salina o agua destilada por el canal vaginal. Posteriormente se absorbe el lavado, se pone una gota de este lavado en un portaobjetos y se hace la evaluaci�n microsc�pica. Otra t�cnica para obtener los frotis es mediante hisopos lubricados que se introducen por la vagina, se hace un ligero movimiento circular para que las c�lulas queden adheridas al hisopo. Inmediatamente despu�s se unta sobre el portaobjetos girando sobre este la punta de algod�n (Cora et al., 2015; Goldman et al., 2007).
Cabe se�alar que, tanto la punta del gotero, como el hisopo no deben ser introducidos a m�s de un cent�metro de la entrada del canal vaginal, ya que, de hacerlo, se corre el riesgo de sobre estimular el cervix e inducir pseudo pre�ez (Cora et al., 2015; Goldman et al., 2007).
Las observaciones al microscopio de las citolog�as vaginales en ambos casos se pueden hacer inmediatamente despu�s de obtener las muestras vaginales sin usar ninguna tinci�n. En general se hace as� cuando no es necesario tener un archivo de los cambios que se presentan y solamente se hacen para tener un seguimiento diario del ciclo de las hembras. As�, se observan las citolog�as, se registran los datos obtenidos por hembra y se pueden reusar los portaobjetos. No obstante, cuando el protocolo de investigaci�n incluye cambios fisiol�gicos que se reflejan en la citolog�a vaginal, entonces es indispensable tener un registro citol�gico. En esos casos es recomendable la tinci�n y fijaci�n de a muestra para la preservaci�n de las citolog�as. ���
Tinciones
Se han descrito varias t�cnicas de tinci�n que pueden resultar eficientes para la evaluaci�n de las citolog�as vaginales. La principal diferencia en la efectividad de las distintas t�cnicas es si son multi o monocrom�ticas. Las t�cnicas multicrom�ticas como Papanicolaou y tricr�mica de Shorr y en menor grado el Diff-Quick, tienen algunas ventajas sobre las t�cnicas monocrom�ticas. Dichas ventajas incluyen distinguir con detalle la diferencia entre el n�cleo y el citoplasma, facilitando la clasificaci�n de los tipos celulares, especialmente las c�lulas superficiales y las escamas de manera m�s exacta. Adem�s, la posibilidad de diferenciar entre las c�lulas acid�filas (superficiales y escamas) y bas�filas (parabasales e intermedias); facilita tambi�n el reconocimiento de la madurez celular. Por �ltimo, permiten observar con facilidad la presencia de leucocitos y eritrocitos. Las desventajas es que son t�cnicas m�s costosas y elaboradas que las t�cnicas monocrom�ticas. �����
Tricr�mica de Shorr
Esta t�cnica es una modificaci�n de la tricr�mica de Masson (Shorr, 1928). Es una tinci�n que ti�e en distintas tonalidades al citoplasma celular conforme su grado de cornificaci�n. Es una tinci�n r�pida, que permite almacenar por varios a�os las muestras te�idas.
Diff-quick
Es una t�cnica modificada de la tinci�n de Wright-Giemsa, pero m�s r�pida. Esta t�cnica tambi�n ofrece la posibilidad de conservar las muestras por varios a�os. No obstante, la afinidad por las diversas estructuras y la distinci�n entre las c�lulas acid�filas y bas�filas no es tan espec�fica como lo son Papanicolaou o tricr�mica de Shorr. ��
Es una t�cnica tambi�n multicrom�tica con las mismas ventajas que la tricr�mica de Shorr. Sin embargo, su mayor desventaja es el tiempo que tarda el protocolo de tinci�n que es entre 25 y 30 minutos.
Azul de metileno
Es una de las t�cnicas monocrom�ticas m�s usadas por su sencillez. Sin embargo, tiene la desventaja de que los eritrocitos no se ti�en y las muestras no se pueden almacenar para observarse posteriormente.
Cuantificaci�n hormonal
Actualmente existen diversas herramientas para la cuantificaci�n de hormonas en los laboratorios de endocrinolog�a e investigaci�n. Estos an�lisis son cruciales para proporcionar informaci�n sobre el estatus reproductivo que permite el diagn�stico o la explicaci�n de un hecho de una manera eficaz. Los podemos clasificar en dos grandes subgrupos dependiendo del fundamento en el que se basan para su funci�n:
1) Inmunoensayos (radioinmunoensayos, inmunoensayos de adsorci�n e inmunoensayos quimioluminoscentes)�
2) Espectrofotometr�a de masas
Inmunoensayos
El principio b�sico de los inmunoensayos consiste en crear una reacci�n de uni�n entre un ant�geno o analito (que es la sustancia o muestra que se desea saber su concentraci�n) con un anticuerpo altamente espec�fico contra dicho ant�geno.
Un ant�geno es cualquier sustancia que al introducirse a un organismo induce o genera una respuesta inmune, provocando la formaci�n de anticuerpos. Mientras que un anticuerpo es una mol�cula producida y secretada por c�lulas plasm�ticas, (linfocitos principalmente) en respuesta a un ant�geno. Al inmunizar a un animal con un ant�geno espec�fico, se provoca una respuesta inmune, produciendo una gran cantidad de anticuerpos. Estos anticuerpos se colectan y purifican para ser utilizados en los diferentes tipos de inmunoensayos, mediante la formaci�n de complejos ant�geno-anticuerpo.
Existen dos tipos de inmunoensayos, dependiendo de la disponibilidad del reactivo: 1) los competitivos o de reactivo limitante y 2) los no competitivos o con exceso de reactivo, tambi�n llamados tipo s�ndwich o inmunom�tricos. En los inmunoan�lisis competitivos, las hormonas por cuantificar compiten con un ant�geno (de la misma naturaleza) marcado por la uni�n al anticuerpo. De esta manera, una mezcla del ant�geno (hormona) con el ant�geno marcado compiten por la uni�n al anticuerpo, de tal manera que mientras mayor sea la concentraci�n de la hormona en una muestra experimental menor ser� el ant�geno marcado que se una al anticuerpo. La se�al obtenida dada por la cuantificaci�n de la marca ser� inversamente proporcional a la concentraci�n de la hormona que se desea cuantificar. Por otra parte, en los ensayos no competitivos, no es el ant�geno el que se marca para competir por la uni�n al anticuerpo, sino se marca el anticuerpo y es libre de unirse al sitio antig�nico de la hormona. La se�al obtenida dada por la cuantificaci�n de la marca es proporcional a la concentraci�n de la hormona que se desea cuantificar.
Radioinmunoensayos (RIAs)
Los primeros m�todos de medici�n hormonal eran muy poco precisos, de hecho, se cuantificaban en el orden de los gramos, miligramos y en algunos casos hasta microgramos. Despu�s de 1960 se empezaron a desarrollar m�todos m�s precisos y la sensibilidad de las pruebas permitieron mediciones de hasta nano-, pico- y fentogramos.
El radioinmunoan�lisis (RIA) fue descrito en 1959 por Berson y Yalow (1959) basando su teor�a en el desplazamiento isot�pico por competencia (Stanczyk et al., 2007). En este ensayo una hormona marcada radiactivamente compite con la hormona (no marcada) de una muestra de concentraci�n desconocida por la uni�n a un anticuerpo, de tal manera que la cantidad de hormona marcada radiactivamente es inversa a la cantidad de hormona sin marcar de la muestra desconocida (Stanczyk et al., 2007). Debido a que los anticuerpos utilizados en un RIA son dise�ados para la competitividad del inmunoensayo, generalmente son altamente espec�ficos. Es por esto por lo que en los a�os 80 fue considerada como la t�cnica ideal para la cuantificaci�n de hormonas esteroides y glicoproteicas en suero (Tan et al., 2018). A pesar de que el RIA fue por mucho tiempo el m�todo m�s confiable, ten�a varias desventajas: requer�an de una gran inversi�n de tiempo (2 a 3 d�as), la sensibilidad relativa era baja, requer�a un alto volumen de muestra (60�l) y ten�a bajo rango din�mico (2-60 ng/mL), aunado al riesgo del personal expuesto a las radiaciones (Tan et al., 2018). El RIA fue una t�cnica ampliamente utilizada hasta los a�os 90, la cual fue posteriormente desplazada por t�cnicas como la quimioluminiscencia o fluorescencia donde se utilizan marcadores enzim�ticos o fluorescentes en lugar de isotopos radiactivos, lo cual permiti� disminuir la producci�n de desechos radiactivos y el costo. Estas t�cnicas tambi�n se basan en el principio de desplazamiento siguiendo las leyes de acci�n de masa.
Inmunoensayos Enzim�ticos de adsorci�n (ELISAs)
El ensayo inmunoenzim�tico de adsorci�n o ELISA es un inmunoensayo de desplazamiento. Entre sus ventajas es que no emplea material radiactivo, es econ�mico y requiere poca cantidad de muestra. Sin embargo, tambi�n tiene la desventaja de que frecuentemente se sobreestiman las concentraciones hormonales debido a la falta de especificidad del anticuerpo. Generalmente, el ant�geno utilizado en la t�cnica de ELISA se encuentra unido a una fase s�lida, es decir, que son previamente fijados a los pozos de microplacas r�gidas de poliestireno, polivinil o polipropileno (Aydin, 2015). Las placas tienen la capacidad de retener en su superficie al ant�geno y al anticuerpo, pero no otros componentes de la fase l�quida, lo que se le conoce como adsorci�n. Las enzimas m�s com�nmente empleadas en los ELISAs son: peroxidasa del r�bano (HRP, por sus siglas en ingl�s), fosfatasa alcalina, glucosa-oxidasa, acetilcolinesterasa y betagalactosidasa, las lecturas de esta �ltima a diferencia de las otras se hacen con un fluor�metro, mientras que las primeras con un espectrofot�metro con un rango de 400 a 600nm dependiendo de las caracter�sticas del conjugado (Aydin, 2015). La reacci�n enzim�tica es bastante r�pida por lo que se pueden obtener resultados en menos de una hora (Aydin, 2015).
En el mercado podemos encontrar cuatro tipos de ELISAS: directos, indirectos, tipo �s�ndwich� y los competitivos, cada uno de ellos tiene diferentes caracter�sticas y usos. El m�todo directo fue el primero en desarrollarse alrededor de 1971 y es empleado para determinar cantidades de ant�genos (Ag, tambi�n conocido como analito) de alto peso molecular. Se llama directo debido a que la superficie de la microplaca es recubierta directamente con el anticuerpo (Ac) espec�fico que identifica al ant�geno (Ag). Posteriormente, el Ag se a�ade a la placa (previamente cubierta con el Ac) y se deja un tiempo de incubaci�n. En esta t�cnica, el Ag o el Ac se encuentran marcados con una enzima. La incubaci�n es seguida por varios lavados. Finalmente se agrega un sustrato apropiado que produce la se�al colorim�trica la cual es medida con un espectrofot�metro de luz. La se�al medida determina la cantidad de Ag o de Ac (Aydin, 2015). La cantidad de color en la muestra determina la concentraci�n del ant�geno deseado, de tal manera que una falta de coloraci�n ser�a interpretada como un resultado negativo.
Cabe se�alar que, algunos estudios determinaron que los inmunoensayos directos no tienen la suficiente sensibilidad y especificidad para cuantificar concentraciones bajas de esteroides, como en el caso de muestras s�ricas de mujeres menop�usicas, hembras seniles, machos o en individuos con tratamiento de inhibidores de la aromatasa (Dowsett & Folkerd, 2005; Stanczyk et al., 2003).
En 1978 se desarroll� el ELISA indirecto, el cual recibe su nombre �porque lo que lo determina no es la cantidad de Ag unido a un primer Ac fijado en la superficie sino a un segundo. En esta t�cnica, el Ag es fijado a la superficie de la microplaca, posteriormente se agrega un primer Ac para obtener un complejo Ag-Ac, despu�s de un lavado se agrega un segundo Ac (marcado enzim�ticamente) que reconoce al primer anticuerpo. Este paso permite que la se�al se magnifique. Finalmente, despu�s de un lavado, se agrega un sustrato para la enzima para producir color. Este m�todo es el m�s utilizado en los laboratorios de endocrinolog�a (Aydin, 2015).
El ELISA tipo s�ndwich se implement� en 1977. En esta t�cnica el primer anticuerpo es fijado a la microplaca, posteriormente se agrega la muestra con el Ag que se desea cuantificar. Tras una breve incubaci�n que remueve los ant�genos no unidos al Ac, se agrega un segundo anticuerpo marcado enzim�ticamente. Para determinar la actividad enzim�tica se a�ade un sustrato al medio y se asegura la coloraci�n. Como el ant�geno se encuentra atrapado entre dos anticuerpos es que se le conoce como tipo s�ndwich. Este tipo de ELISA ha demostrado ser entre dos y cinco veces m�s sensitivo que los otros ELISAs, por lo que son actualmente m�s comunes en los laboratorios de diagn�stico (Aydin, 2015).
Mientras que el ELISA competitivo se empez� a usar m�s tempranamente (1976). En esta t�cnica, la superficie de las microplacas est� recubierta o con el Ac espec�fico para el Ag que se desea medir o con el Ag. Tanto la muestra a ser determinada como el Ag o Ac marcado enzim�ticamente se agregan al mismo tiempo, por lo que compiten entre ellos para unirse al Ac o al Ag que est� unido en la superficie. En este tipo de ensayo hay una proporci�n inversa entre la concentraci�n del analito y la intensidad de la coloraci�n. De tal manera si la intensidad de la coloraci�n del Ag o Ac analizado tiene una alta absorbancia su concentraci�n es menor y viceversa (Aydin, 2015).
Cabe se�alar que anteriormente los inmunoensayos analizaban un analito por ensayo, por lo que se requer�an varias corridas para detectar todos los componentes de una muestra, tomaban mucho tiempo y requer�an de diferentes reactivos. Actualmente, ya se han desarrollado diversos inmunoensayos multi-analitos.
Inmunoensayos quimioluminiscentes (CLIA)
Otro tipo de inmunoensayo es aquel que, en lugar de utilizar una marca enzim�tica, emplea una marca quimioluminiscente. La quimioluminiscencia se define como la emisi�n de radiaci�n electromagn�tica causada por una reacci�n qu�mica que produce luz. Los inmunoensayos quimioluminiscentes (CLIA) combinan la t�cnica quimioluminiscente con las reacciones inmunoqu�micas y determinan la concentraci�n de un analito en una muestra de acuerdo con la intensidad de luminiscencia que una reacci�n qu�mica produce (Wang et al., 2012). Este tipo de ensayo es muy parecido a otros ensayos con marcas isot�picas (RIA) o no isot�picas (ELISA), pero en este caso el anticuerpo que se emplea se marca con un qu�mico que al reaccionar genera una emisi�n de luz, la cual es detectada por un sistema �ptico. Los sustratos m�s utilizados en esta t�cnica son el luminol, isoluminol y sus derivados, pirogalol, derivados del ester de acridino o rutenio, entre otros. En esta t�cnica, tambi�n se usan enzimas para marcar las prote�nas, siendo las m�s comunes la fosfatasa alcalina y la peroxidasa del r�bano, las cuales, en presencia de compuestos oxidantes como el per�xido de hidr�geno, el ox�geno o el hipoclorito emiten luz durante la reacci�n de oxidaci�n. Los CLIA se han utilizado en las �ltimas d�cadas para detectar analitos cuyas concentraciones son extremadamente bajas, como drogas, marcadores serol�gicos y hormonas (l�mite de detecci�n = zeptomolas 10-21 mol) (Cinquanta et al., 2017). Con el avance de la biolog�a molecular, la nanotecnolog�a y los biosensores se han desarrollado nuevos sistemas de inmunoensayos quimioluminiscente que permiten la cuantificaci�n de diversos analitos al mismo tiempo en una sola muestra, mediante el uso de chips con un sistema de detecci�n multiplex (Cinquanta et al., 2017; Wang et al., 2012). Esto reduce los tiempos de an�lisis y reduce tambi�n la cantidad de muestra inicial que se requiere para el proceso.
Espectrofotometr�a de masas
La espectrometr�a de masas mide la masa molecular del compuesto por analizar, su estructura o simplemente su presencia y concentraci�n. Esta t�cnica se basa en fragmentar las mol�culas del compuesto para posteriormente separarlas y medirlas en funci�n de su relaci�n masa/carga (Rodriguez, 2011). Es el mejor m�todo para la cuantificaci�n de esteroides conjugados ya que tiene una alta especificidad y precisi�n. Varios estudios han demostrado que usar tanto la cromatograf�a de gases o l�quida en conjunto con la espectrofotometr�a de masas aumenta la sensibilidad y la especificidad de la cuantificaci�n (Mart�nez et al., 2014; Wang et al., 2015). Otra ventaja de esta t�cnica es que varios esteroides pueden ser cuantificados en una misma muestra de suero. Sin embargo, estas t�cnicas, no son accesibles para los laboratorios de rutina debido al alto costo del instrumental y reactivos, as� como la necesidad de personal altamente calificado y el consumo de tiempo en los procesos.
Consideraciones generales para la cuantificaci�n de hormonas sexuales
La mayor�a de las hormonas involucradas con los procesos reproductivos, se secretan de manera puls�til, r�tmica y generalmente tienen una r�pida respuesta ante est�mulos end�genos propios del individuo. (Barbieri, 2014; Rodriguez, 2011). Esto quiere decir que su concentraci�n presenta variaciones a lo largo del d�a o dependiendo de la etapa del ciclo menstrual/estral. Por lo que es recomendable que para cualquier an�lisis de concentraci�n se considere tomar las muestra a la misma hora del d�a y considerar la fase del ciclo en la que se encuentra el sujeto de estudio. Tambi�n se recomienda hacer un pool de muestras seriadas. �A su vez otros factores que pueden tener una incidencia en la variaci�n de la concentraci�n de las hormonas circulantes pueden ser: edad, sexo, estado f�sico, presencia de embarazo, lactancia, menopausia, estr�s, fiebre, presencia de alguna patolog�a, ingesti�n de alimentos, tratamientos farmacol�gicos y ayuno, entre otras (Rodriguez, 2011).
Tambi�n es importante considerar la estructura qu�mica de la hormona a cuantificar. En el caso de algunas hormonas esteroides que son de origen lip�dico, generalmente se encuentra en el suero unidas a globulinas espec�ficas que muchas veces no son debidamente reconocidas por el anticuerpo. Por lo anterior, es recomendable que se realice un paso previo a la cuantificaci�n con extracci�n org�nica.
Por todo lo anterior, es relevante mencionar que cada laboratorio ya sea cl�nico o de investigaci�n, debe establecer sus propias normas y protocolos para poder minimizar la variabilidad en la cuantificaci�n de hormonas debida a este tipo de factores ajenos a la concentraci�n propia de la muestra (Rodriguez, 2011).
Agradecimientos
Los autores agradecemos a la Psic. Gema Estudillo Mendoza por su apoyo en el laboratorio para la tinci�n de las citolog�as vaginales de las ratas. Agradecemos tambi�n al Dr. Octavio Mej�a por la toma de las fotograf�as que incluimos en este trabajo. Asimismo, extendemos nuestro agradecimiento al Lic. en Artes Visuales Emiliano Mondrag�n por la edici�n de la figura y fotograf�as.
Conflicto de intereses
Ninguno.
Derechos �ticos para el uso de animales
Los experimentos con animales se adhirieron a las directrices del ARRIVE y se realizaron de acuerdo a la gu�a sobre el cuidado y utilizaci�n de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (NIH no: 8023, revised 1978).
REFERENCIAS
Albertini, D. F. (2015). The Mammalian Oocyte. In Knobil and Neill�s Physiology of Reproduction: Two-Volume Set (Vol. 1). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-397175-3.00002-8
Allen, E., & Doisy, E. A. (1923). An ovarian hormone. Journal of the American Medical Association, 81(21), 1808. https://doi.org/10.1001/jama.1923.02650210074033
Antonov, A. L. (2017). Application of exfoliative vaginal cytology in clinical canine reproduction � a review. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 20(3), 193�203. https://doi.org/10.15547/bjvm.997
Aydin, S. (2015). A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4�15. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012
Barbieri, R. L. (2014). The endocrinology of the menstrual cycle. In Z. Rosenwaks & P. M. Wassarman (Eds.), Human Fertility (Vol. 1154, Issue April 2014). Springer New York. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-0659-8
Beky�rek, T., Lima, N., & Bayra, G. (2002). Diagnosis of sexual cycle by means of vaginal smear method in the chinchilla (Chinchilla lanigera). Laboratory Animals, 36(1), 51�60. https://doi.org/10.1258/0023677021911768
Berson, B. S. A., & Yalow, R. S. (1959). Quantitative aspects of the reaction between insulin and insulin-binding antibody. The Journal of Clinical Investigation, 38(11), 1996�2016.
Cinquanta, L., Fontana, D. E., & Bizzaro, N. (2017). Chemiluminescent immunoassay technology: what does it change in autoantibody detection? Autoimmunity Highlights, 8(1). https://doi.org/10.1007/s13317-017-0097-2
Cora, M. C., Kooistra, L., & Travlos, G. (2015). Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse:Review and Criteria for the Staging of the Estrous Cycle Using Stained Vaginal Smears. Toxicologic Pathology, 43(6), 776�793. https://doi.org/10.1177/0192623315570339
De Tomasi, J. B., Crespo, A. A., & Crespo, A. F. (2012). Desarrollo folicular en el ovario. Revista Salud Quintana Roo, 5(19), 12�18. https://www.imbiomed.com.mx/articulo.php?id=82826
Dorgan, J. F., Fears, T. R., McMahon, R. P., Aronson Friedman, L., Patterson, B. H., & Greenhut, S. F. (2002). Measurement of steroid sex hormones in serum: A comparison of radioimmunoassay and mass spectrometry. Steroids, 67(3�4), 151�158. https://doi.org/10.1016/S0039-128X(01)00147-7
Dowsett, M., & Folkerd, E. (2005). Deficits in plasma oestradiol measurement in studies and management of breast cancer. Breast Cancer Research, 7(1), 1�4. https://doi.org/10.1186/bcr960
Duffy, D. M., Ko, C., Jo, M., Brannstrom, M., & Curry, T. E. (2019). Ovulation: Parallels with inflammatory processes. Endocrine Reviews, 40(2), 369�416. https://doi.org/10.1210/er.2018-00075
Evans, H. M., & Long, J. A. (1922). Characteristic Effects upon Growth, Oestrus and Ovulation Induced by the Intraperitoneal Administration of Fresh Anterior Hypophyseal Substance. Proceedings of the National Academy of Sciences, 8(3), 38�39. https://doi.org/10.1073/pnas.8.3.38
Falender, A. E., Shimada, M., Lo, Y. K., & Richards, J. A. S. (2005). TAF4b, a TBP associated factor, is required for oocyte development and function. Developmental Biology, 288(2), 405�419. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2005.09.038
Farage, M. A., Miller, K. W., & Sobel, J. D. (2010). Infectious Diseases : Research and Treatment Dynamics of the Vaginal Ecosystem-Hormonal Influences. Infectious Diseases: Research and Treatment, 3, 1�15.
Faupel-Badger, J. M., Fuhrman, B. J., Xu, X., Falk, R. T., Keefer, L. K., Veenstra, T. D., Hoover, R. N., & Ziegler, R. G. (2010). Comparison of liquid chromatography-tandem mass spectrometry, RIA, and ELISA methods for measurement of urinary estrogens. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 19(1), 292�300. https://doi.org/10.1158/1055-9965.EPI-09-0643
Fitzpatrick, S. L., & Richards, J. A. S. (1994). Identification of a cyclic adenosine 3′, 5′-monophosphate-response element in the rat aromatase promoter that is required for transcriptional activation in rat granulosa cells and R2C leydig cells. Molecular Endocrinology, 8(10), 1309�1319. https://doi.org/10.1210/mend.8.10.7854348
Frederick, J. L., Shimanuki, T., & DiZerega, G. S. (1984). Initiation of angiogenesis by human follicular fluid. Science, 224, 389�390.
Fujii, T., Hoover, D. J., & Channing, C. P. (1983). Changes in inhibin activity, and progesterone, oestrogen and androstenedione concentrations, in rat follicular fluid throughout the oestrous cycle. Journal of Reproduction and Fertility, 69(1), 307�314. https://doi.org/10.1530/jrf.0.0690307
Goldman, J. M., Murr, A. S., & Cooper, R. L. (2007). The rodent estrous cycle: Characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology, 80(2), 84�97. https://doi.org/10.1002/bdrb.20106
Halasz, M., & Szekeres-Bartho, J. (2013). The role of progesterone in implantation and trophoblast invasion. Journal of Reproductive Immunology, 97(1), 43�50. https://doi.org/10.1016/j.jri.2012.10.011
Han, Y., Jiang, T., Shi, J., Liu, A., Liu, L. (2023) Review: Role and regulatory mechanism of inhibin in animal reproductive system. Theriogenology, 202, 10-20. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2023.02.016
Hansen, K. R., Eisenberg, E., Baker, V., Hill, M. J., Chen, S., Talken, S., Diamond, M. P., Legro, R. S., Coutifaris, C., Alvero, R., Robinson, R. D., Casson, P., Christman, G. M., Santoro, N., Zhang, H., & Wild, R. A. (2018). Midluteal progesterone: A marker of treatment outcomes in couples with unexplained infertility. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 103(7), 2743�2751. https://doi.org/10.1210/jc.2018-00642
Ingram, B. D. L. (1959). The vaginal smear of the senile laboratory rats.
Kaushik, T., Mishra, R., Singh, R. K., & Bajpai, S. (2020). Role of connexins in female reproductive system and endometriosis. Journal of Gynecology Obstetrics and Human Reproduction, 49(6), 101705. https://doi.org/10.1016/j.jogoh.2020.101705
Le, J., Thomas, N., & Gurvich, C. (2020). Cognition, the menstrual cycle, and premenstrual disorders: A review. Brain Sciences, 10(4), 1�14. https://doi.org/10.3390/brainsci10040198
Lee, E. B., Praveen Chakravarthi, V., Wolfe, M. W., & Karim Rumi, M. A. (2021). ERβ regulation of gonadotropin responses during folliculogenesis. International Journal of Molecular Sciences, 22(19). https://doi.org/10.3390/ijms221910348
Lefi�vre, L., Conner, S. J., Salpekar, A., Olufowobi, O., Ashton, P., Pavlovic, B., Lenton, W., Afnan, M., Brewis, I. A., Monk, M., Hughes, D. C., & Barratt, C. L. R. (2004). Four zona pellucida glycoproteins are expressed in the human. Human Reproduction, 19(7), 1580�1586. https://doi.org/10.1093/humrep/deh301
Liu, C. F., Barsoum, I., Gupta, R., Hofmann, M. C., & Yao, H. H. (2009). Stem cell potential of the mammalian gonad. Frontiers in bioscience (Elite edition), 1(2), 510�518. https://doi.org/10.2741/e47
Mart�nez, D., Correa Vidal, M., Oropesa, R., & Gonz�lez, O. (2014). Cuantificaci�n simult�nea de andr�genos, estr�genos, corticoides y pregnanos mediante cromatograf�a de gases acoplada a espectrometr�a de masas. Revista Cubana de Farmacia, 48(4), 550�561. http://scielo.sld.cuhttp//scielo.sld.cu
Mishra, B., Park, Y. J., Wilson, K., & Jo, M. (2015). X-linked lymphocyte regulated gene 5c-like (Xlr5c-like) Is a Novel Target of Progesterone Action in Granulosa Cells of Periovulatory Rat Ovaries. Physiology & Behavior, 5, 226�238. https://doi.org/10.1016/j.mce.2015.05.008
Owen, J. A. (1975). Physiology of the menstrual cycle. American Journal of Clinical Nutrition, 28(4), 333�338. https://doi.org/10.1093/ajcn/28.4.333
Paccola, C. C., Resende, C. G., Stumpp, T., Miraglia, S. M., & Cipriano, I. (2013). The rat estrous cycle revisited: a quantitative and qualitative analysis. Anim. Reprod, 10(4), 677�683.
Pangas, S. A., & Rajkovic, A. (2015). Follicular development. In J. D. Knobil, E. and Neill (Ed.), Physiology of reproduction (Fourth Edi, pp. 947�995). Academic Press Inc.
Reddy, P., Liu, L., Adhikari, D., Jagarlamudi, K., Rajareddy, S., Shen, Y., Du, C., Tang, W., H�m�l�inen, T., Peng, S. L., Lan, Z. J., Cooney, A. J., Huhtaniemi, I., & Liu, K. (2008). Oocyte-specific deletion of pten causes premature activation of the primordial follicle pool. Science, 319(5863), 611�613. https://doi.org/10.1126/science.1152257
Richards, J. S. (1980). Maturation of ovarian follicles: actions and interactions of pituitary and ovarian hormones on follicular cell differentiation. Physiological Reviews, 60(1), 51�89. https://doi.org/10.1152/physrev.1980.60.1.51
Richards, J. (2018). The ovarian cycle. In G. Litwacl (Ed.), Vitamins and Hormones (First edit, pp. 1�18). Academic Press.
Rodriguez, A. (2011). Libro laboratorio clinico y la funcion hormonal (C. Catro Fern�ndez, L. Rodelgo Jim�nez, M. A. Ruis Gin�s, & G. Ru�z Mart�n (eds). Asociaci�n Castellano-Manchega de An�lisis Cl�nicos.
Rosales Torres, A. M., & S�nchez Guzm�n, A. (2008). Apoptosis en la atresia folicular y la regresi�n del cuerpo l�teo. Revisi�n. Tecnica Pecuaria En Mexico, 46(2), 159�182.
Shorr, E. (1928). A new technic for staining vaginal smears. Science, 68(1752), 87�88. https://doi.org/10.1126/science.68.1752.87
Srisuparp, S., Strakova, Z., & Fazleabas, A. T. (2001). The Role of Chorionic Gonadotropin (CG) in Blastocyst Implantation. Archives of Medical Research, 32, 627�634. https://doi.org/10.1016/s0188-4409(01)00330-7
Stanczyk, F. Z., Cho, M. M., Endres, D. B., Morrison, J. L., Patel, S., & Paulson, R. J. (2003). Limitations of direct estradiol and testosterone immunoassay kits. Steroids, 68(14), 1173�1178. https://doi.org/10.1016/j.steroids.2003.08.012
Stanczyk, F. Z., Lee, J. S., & Santen, R. J. (2007). Standardization of steroid hormone assays: Why, how, and when? Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 16(9), 1713�1719. https://doi.org/10.1158/1055-9965.EPI-06-0765
Stockard, C. R., & Papanicolaou, G. N. (1917). A rhythmical �heat period� in the guinea-pig. Science, XLVI(1176), 42�44.
Tan, X., David, A., Day, J., Tang, H., Dixon, E. R., Zhu, H., Chen, Y.-C., Khaing Oo, M. K., Shikanov, A., & Fan, X. (2018). Rapid Mouse Follicle Stimulating Hormone Quantification and Estrus Cycle Analysis Using an Automated Microfluidic Chemiluminescent ELISA System. ACS Sensors, 3(11), 2327�2334. https://doi.org/10.1021/acssensors.8b00641
Taraborrelli, S. (2015). Physiology, production and action of progesterone. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, 94, 8�16. https://doi.org/10.1111/aogs.12771
Toral Delgado, L. (2017). Identificaci�n del ciclo estral. BENEM�RITA UNIVERSIDAD AUT�NOMA DE PUEBLA.
Wang, C., Wu, J., Zong, C., Xu, J., & Ju, H. X. (2012). Chemiluminescent immunoassay and its applications. Fenxi Huaxue/ Chinese Journal of Analytical Chemistry, 40(1), 3�10. https://doi.org/10.1016/S1872-2040(11)60518-5
Wang, Q., Bottalico, L., Mesaros, C., & Blair, I. A. (2015). Analysis of estrogens and androgens in postmenopausal serum and plasma by liquid chromatography�mass spectrometry. Steroids, 99(1), 76�83. https://doi.org/10.1016/j.steroids.2014.08.02
Wuttke, W., Pitzel, L., Seidlov�-Wuttke, D., & Hinney, B. (2001). LH pulses and the corpus luteum: The luteal phase deficiency (LPD). Vitamins and Hormones, 63, 131�158. https://doi.org/10.1016/s0083-6729(01)63005-x
Yen, S. S. C., Jaffe, R. B., & Barbieri, R. L. (2019). Reproductive Endocrinology: physiology, pathology, and clinical management (J. Strauss & R. Barberi (eds.)). Elsevier. https://doi.org/10.1016/C2015-0-05642-8
Zeleznik, A. J., & Plant, T. M. (2015). Control of the Menstrual Cycle. In Knobil and Neill�s Physiology of Reproduction (Fourth Edi, Vol. 2, pp. 1307�1361). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-397175-3.00028-4